Thu nhỏ phân tích Epigenetic AlphaLISA
Epigenetics (Di truyền học biểu sinh) đươc xem như mục tiêu quan trọng để phân tích thuốc và nghiên cứu ung thư. Khi các chương trình mở rộng quy mô để đánh giá nhiều mục tiêu mới liên quan đến biểu hiện epigenetic, cần có các thiết bị và kỹ thuật mới để cho phép sàng lọc epigenetic thông lượng cao hiệu quả và có khả năng tái tạo. Sự kết hợp giữa thiết bị mạnh mẽ và chính xác từ Beckman Coulter Life Sciences và BMG LABTECH cho phép thu nhỏ và tự động hóa các bộ xét nghiệm PerkinElmer AlphaLISA epigenetic mà không ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng dữ liệu.
Tổng quan
Truyền chất lỏng bằng sóng âm và Bộ thao tác chất lỏng Echo
Bộ thao tác chất lỏng Echo tối ưu việc truyền chất lỏng bằng cách sử dụng năng lượng sóng âm để đẩy chất lỏng ra. Bộ thao tác chất lỏng Echo có thể truyền các hợp chất, mẫu, thuốc thử và hạt với thể tích dưới microlit sang các định dạng xét nghiệm mật độ cao chỉ sử dụng năng lượng sóng âm – không tiếp xúc hoặc không cần các đầu tip, do đó giảm nguy cơ nhiễm lẫn thuốc thử và loại bỏ chi phí đầu tip.
Việc thu nhỏ xét nghiệm làm tăng năng suất sàng lọc và giảm chi phí vận hành. Với khả năng truyền chất lỏng chính xác với mức tăng 2,5 nL và 25 nL, Bộ thao tác chất lỏng Echo cung cấp giải pháp xử lý chất lỏng hiệu suất cao cho phép thu nhỏ các xét nghiệm sàng lọc mà không ảnh hưởng đến chất lượng dữ liệu.
Đầu đọc vi tấm PHERAstar FS
Đầu đọc vi tấm đa chế độ PHERAstar FS, với độ nhạy cao nhất và thời gian đọc xét nghiệm thấp nhất ở mật độ cao tới 3456 giếng, là sự bổ sung hoàn hảo cho Bộ thao tác chất lỏng Echo. Đầu đọc vi tấm PHERAstar FS sử dụng mô-đun laser chuyên dụng và mô-đun xét nghiệm cụ thể để phát hiện AlphaScreen / AlphaLISA, cho phép thu thập dữ liệu ở khối lượng xét nghiệm thấp. PHERAstar FS và Bộ thao tác chất lỏng Echo cùng nhau cung cấp một giải pháp chất lượng để sàng lọc epigenetic thông lượng cao, hiệu quả về mặt chi phí.
Thí nghiệm PerkinElmer AlphaLISA
Xét nghiệm AlphaLISA thường được thực hiện ở thể tích khoảng 20 đến 25 μL. Tuy nhiên, với mức tăng chất lỏng truyền 2,5 nL và 25 nL của Bộ thao tác chất lỏng Echo, khối lượng xét nghiệm có thể giảm đáng kể. Trong nghiên cứu này, Beckman Coulter có thể giảm thể tích xét nghiệm methyltransferase xuống mức thấp nhất là 5 μL với kết quả tối ưu
Các thí nghiệm
Xét nghiệm AlphaLISA Methlytransferase
Beckman Coulter đã nghiên cứu quá trình thu nhỏ của xét nghiệm AlphaLISA để đo mức độ monomethyl hóa của peptit Histone H3 (1-21) được biotatin hóa ở Lysine 4 bằng enzyme SET7/9. Trong xét nghiệm này, các hạt Acceptor liên hợp antimethyl-Histone H3 Lysine 4 liên kết đặc hiệu với peptit Histone H3 đã biến đổi. Sau đó, các hạt Donor Streptavidin liên kết với peptide biotatin hóa, đưa chúng đến gần các hạt Acceptor. Khi kích thích các hạt Donor, các phân tử oxy nhóm đơn được tạo ra, dẫn đến sự truyền năng lượng đến các hạt Acceptor, sau đó hạt này phát ra tín hiệu ở bước sóng 615 nm.
Phương pháp
Dung dịch gốc S-(5′-adenosyl)-L-methionine clorua (SAM) được điều chế ở nồng độ 30 mM trong 5 mM H2SO4/10% etanol (v/v) trong H2O. Peptit Histone H3 đã được pha loãng trong dung dịch đệm xét nghiệm đến nồng độ 200 nM (4X), SAM đến 400 nM (4X) và enzyme SET7/9 đến 4 nM (4X) ngay trước khi sử dụng.
Đối với cả xét nghiệm 384 giếng và 1536 giếng, đường phản ứng liều của hai chất ức chế đã biết, S-(5′- adenosyl)-L-homocysteine (SAH) và sinefungin, lần đầu tiên được thêm vào Đầu đọc vi tấm đủ tiêu chuẩn Echo với 384 giếng, sau đó được chuyển sang các đĩa xét nghiệm bằng Bộ thao tác chất lỏng Echo 555. 40 nL hợp chất được chuyển trong thử nghiệm 10 μL và 20 nL hợp chất được truyền trong thử nghiệm 5 μL.
Dung dịch đệm khảo nghiệm, enzyme và peptide + SAM (hoặc peptide chỉ dành cho đối chứng âm tính) sau đó được thêm vào các vi tấm. Trong các thử nghiệm 5 μL và 10 μL, việc bổ sung được thực hiện bằng cách sử dụng Bộ thao tác chất lỏng Echo 525. Các vi tấm được đậy kín, ly tâm nhanh ở tốc độ 1000 vòng/phút và ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng (RT).
Các hạt Acceptor AlphaLISA kháng methyl-Histone H3 Lysine 4 (H3K4me1-2) được pha loãng trong chất đệm Epigenetic 1 1X ở nồng độ 100 μg/mL, sau đó được thêm vào Đầu đọc vi tấm đủ tiêu chuẩn Echo với 384 giếng. Sau đó, các hạt được chuyển sang các vi tấm xét nghiệm bằng Bộ thao tác chất lỏng Echo 525 đến nồng độ cuối cùng là 20 μg/mL. Các vi tấm được đậy kín, ly tâm nhanh ở tốc độ 1000 vòng/phút, lắc và ủ trong 60 phút ở RT, trong điều kiện tối.
Các hạt Donor Streptavidin đã được pha loãng trong chất đệm 1 1X ở nồng độ 50 μg/mL, được thêm vào nguồn Đầu đọc vi tấm đủ tiêu chuẩn Echo với 384 giếng và được chuyển đến các đĩa xét nghiệm bằng Bộ xử lý chất lỏng Echo 525 đến nồng độ cuối cùng là 20 μg/ mL. Các vi tấm được đậy kín, ly tâm nhanh ở tốc độ 1000 vòng/phút, lắc và ủ trong 30 phút ở RT, trong bóng tối. Sau đó, các vi tấm được đọc trên máy đọc vi tấm PHERAstar FS.
Khi so sánh các yếu tố tín hiệu với nền (S/B) và Z’, các đối chứng dương và âm cũng được chạy ở thể tích xét nghiệm tiêu chuẩn 25 µL ở định dạng 384 giếng. Việc bổ sung thuốc thử được thực hiện bằng cách sử dụng pipet thủ công.
| Tổng khối lượng | 25 µL | 10 µL | 5 µL |
| Chất đệm xét nghiệm | 5 µL | 2 µL | 1 µL |
| Hợp chất hoặc DMSO | 100 nL | 40 nL | 20 nL |
| Enzim SET7/9 (4X) | 2,5 µL | 1 µL | 500 nL |
| Hỗn hợp H3/SAM (4X) | 2,5 µL | 1 µL | 500 nL |
| Hạt Acceptor Alpha | 5 µL | 2 µL | 1 µL |
| Hạt Donor Alpha | 10 µL | 4 µL | 2 µL |
Bảng 1: Thể tích thuốc thử và mẫu được thêm vào cho mỗi thể tích xét nghiệm
Các phương pháp được điều chỉnh từ Gauthier, N, et al., Phát triển các xét nghiệm Methyltransferase và Demethylase không phóng xạ đồng nhất nhắm mục tiêu Histone H3 Lysine 4, J Biomol Screen, 2012 17:49, trực tuyến ngày 21 tháng 9 năm 2011
Kết quả
Beckman Coulter đã tính toán tín hiệu nền và hệ số Z’ cho các định dạng xét nghiệm khác nhau và so sánh dữ liệu của các định dạng xét nghiệm thu nhỏ với định dạng xét nghiệm 25 μL. Mặc dù tín hiệu tới nền thấp hơn trong các xét nghiệm thu nhỏ, nhưng chất lượng xét nghiệm tổng thể ở các định dạng xét nghiệm thu nhỏ vẫn tối ưu, với hệ số Z’ là 0,82 trở lên cho tất cả các định dạng. Để so sánh, xét nghiệm 25 µL, được lắp ráp thủ công, có hệ số Z’ là 0,73.
| Định dạng xét nghiệm | Kỹ thuật truyền chất lỏng | S/B | Yếu tố Z’ |
| 384 giếng, 25 µL | Thủ công | 9,4 | 0,73 |
| 384 giếng, 10 µL | Hệ thống Echo | 6,6 | 0,82 |
| 384 giếng, 5 µL | Hệ thống Echo | 5,5 | 0,83 |
| 1536 giếng, 1 µL | Hệ thống Echo | 6,5 | 0,85 |
Bảng 2: So sánh các hệ số tín hiệu trên nền và Z’ giữa định dạng xét nghiệm thể tích chuẩn và định dạng xét nghiệm thu nhỏ
| Định dạng xét nghiệm | IC50 – SAH | IC50 – Sinefungin |
| 384 giếng, 10 µL | 515 nM | 40 mM |
| 384 giếng, 5 µL | 566 nM | 156 nM |
| 1536 giếng, 5 µL | 441 nM | 161 nM |
Bảng 3: So sánh giá trị IC50 của SAH và sinefungin ở thể tích chuẩn và định dạng xét nghiệm thu nhỏ
Tự động hóa với Trạm máy phòng thí nghiệm Access
Xét nghiệm AlphaLISA epigenetic có thể dễ dàng được điều chỉnh để tự động hóa với Trạm máy Phòng thí nghiệm Access. Hệ thống Access cho phép tích hợp liền mạch Máy xử lý chất lỏng Echo, bao gồm máy rót số lượng lớn, máy hàn vi tấm, máy tách niêm phong, máy ly tâm và đầu đọc vi tấm như PHERAstar FS. Phần mềm điều khiển tự động hóa Tempo quản lý tất cả quá trình xử lý vi tấm và có các tính năng lập lịch để kiểm soát thời gian ủ vi tấm. Bằng cách này, việc lắp ráp xét nghiệm có thể được tự động hóa từ đầu đến đọc trên hệ thống Access, nhờ đó tăng thông lượng và tối đa hóa thời gian thực hiện.
Tóm tắt
Khi epigenetic phát triển như một lĩnh vực trọng tâm, nhu cầu thực hiện các xét nghiệm này trên quy mô lớn hơn theo cách hiệu quả về mặt chi phí càng lớn hơn. Làm như vậy đòi hỏi khả năng điều chỉnh các xét nghiệm này thành các định dạng thu nhỏ và mật độ cao hơn. Với Bộ thao tác chất lỏng Echo, thuốc thử và hợp chất có thể được truyền chính xác ở thể tích nano lít, cho phép lắp ráp các xét nghiệm AlphaLISA epigenetic thu nhỏ trong khi duy trì hoặc cải thiện chất lượng dữ liệu. Ngoài ra, với Trạm máy phòng thí nghiệm Access, toàn bộ quy trình làm việc có thể được tự động hóa dễ dàng để tăng thông lượng và năng suất.
Nguyên vật liệu
| Thiết bị | Nhà sản xuất |
| Bộ thao tác chất lỏng Echo 525 | Beckman Coulter Life Sciences |
| Bộ thao tác chất lỏng Echo 555 | Beckman Coulter Life Sciences |
| Máy ly tâm vi tấm | Agilent Technologies |
| Máy hàn vi tấm nhiệt PlateLoc | Agilent Technologies |
| Đầu đọc vi tấm PHERAstar FS | BMG LABTECH |
| Máy tách niêm phong vi tấm tự động XPeel | Brooks Automation |
| Teleshake | INHECO |
| Thuốc thử | Nhà sản xuất | Mã sản phẩm |
| SET7/9 (human) Enzym, Tái tổ hợp | Enzo Life Sciences | ALX-201-178-C100 |
| Histone H3 (1 – 21) Peptide, Biotin hóa | AnaSpec | AS-61702 |
| Hạt Acceptor AlphaLISA chống methyl-Histone H3 Lysine 4 (H3K4me1-2) | PerkinElmer | AL116 |
| Hạt Donor Alpha Streptavidin | PerkinElmer | 6760002 |
| Chất đệm biểu sinh AlphaLISA 5X 1 Bộ | PerkinElmer | AL008 |
| S-(5′-Adenosyl)-L-methionine clorua (SAM) | Sigma | A7007 |
| S-(5′-Adenosyl)-L-homocysteine (SAH) | Sigma | A9384 |
| Sinefungin | Enzo Life Sciences | ALX-380-070 |
Dung dịch đệm xét nghiệm: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,01% Tween-20
| Vật tư tiêu hao | Nhà sản xuất | Mã sản phẩm |
| Vi tấm đủ tiêu chuẩn Polypropylene Echo 384 giếng | Beckman Coulter Life Sciences | P-05525 |
| Round Bottom 384 giếng, White Microplate | Corning Life Sciences | 3674 |
| Flat Bottom 1536 giếng, White Microplate | Corning Life Sciences | 3729 |
EN