Sàng lọc tinh thể protein với công nghệ thao tác chất lỏng Echo
Các Bộ thao tác chất lỏng Echo cho phép hình thành tinh thể protein với thể tích nhỏ giọt tới 50 nL. Khối lượng nanolit của thuốc thử protein và tinh thể có thể được chuyển vào các giếng nhỏ giọt của các tấm tinh thể. Vị trí nhỏ giọt chính xác giúp loại bỏ ô nhiễm chéo và đảm bảo đúng vị trí nhỏ giọt để trộn các dung dịch protein và tinh thể. Truyền thuốc thử chính xác đảm bảo các thử nghiệm kết tinh có thể lặp lại. Với Phân tích chất lỏng động, chỉ cần một cài đặt lớp chất lỏng duy nhất để truyền tất cả thuốc thử từ lưới tinh thể—loại bỏ nhu cầu hiệu chuẩn nhiều lần hoặc tối ưu hóa lặp lại cài đặt lớp chất lỏng. Ngoài việc chuyển thuốc thử, Bộ thao tác chất lỏng Echo cũng có thể sử dụng Phân tích chất lỏng động để chuyển thuốc thử gốc nồng độ cao một cách nhanh chóng, cho phép người vận hành tạo ra lưới thử nghiệm tối ưu hóa mà không cần thực hiện tất cả các biến thể riêng lẻ.
Thí nghiệm 1
Sàng lọc protein bằng lưới tinh thể
Lưới tinh thể thường được sử dụng như một trong những bước đầu tiên trong sàng lọc tinh thể protein. Những lưới thử nghiệm này bao gồm nhiều giải pháp khác nhau với thành phần, độ nhớt và sức căng bề mặt khác nhau. Một số có bán trên thị trường đã được thử nghiệm để xác định xem các đặc tính Phân tích chất lỏng động của Bộ thao tác chất lỏng Echo có thể truyền thuốc thử với một cài đặt loại chất lỏng duy nhất hay không. Tổng cộng 480 giải pháp khác nhau đã được thử nghiệm:
- Crystal Screen HT (Nghiên cứu Hampton, HR2-130)
- PEG/Ion HT (HR2-139)
- Chỉ số HT (HR2-134)
- Wizard I&II (Khoa học sinh học ngọc lục bảo, EBS-WIZ-12-B)
- Bộ ComPAS (Qiagen, 130917)
Phương pháp
30 μL thuốc thử sàng lọc tinh thể học được chuyển sang tấm nguồn đủ tiêu chuẩn Echo bằng polypropylen 384 giếng (P-05525). Tấm nguồn sau đó được ly tâm. Thể tích danh nghĩa 30 nL của mỗi thuốc thử được chuyển bằng Bộ thao tác chất lỏng Echo từ tấm nguồn sang giấy màu vàng nhạy với nước (TeeJet Technologies, 20301-1N), giấy này sẽ chuyển sang màu xanh lam khi tiếp xúc với chất lỏng. Chấm màu xanh lam trên tờ giấy ở vị trí dự kiến là dấu hiệu cho thấy thuốc thử đã được truyền đi. Bộ thao tác chất lỏng Echo chuyển theo gia số 2,5 nL, do đó, lần chuyển 30 nL bao gồm 12 lần chuyển giọt.
Kết quả
477/480 (>99%) thuốc thử được thử nghiệm đã được chuyển bằng Bộ thao tác chất lỏng Echo. Khối lượng giảm có vẻ ổn định; sự kết hợp (tính nhất quán từng giọt) của quá trình chuyển giao được thể hiện rõ ràng trong Hình 1.
Thí nghiệm 2
Thử nghiệm kết tinh với lysozyme và thaumatin
Việc tạo ra các lượt truy cập tinh thể đã được thử nghiệm với các protein mô hình lysozyme và thaumatin bằng cách sử dụng mảng lưới Hampton Crystal Screen HT. So sánh thử nghiệm kết tinh được thực hiện bằng cách chuyển thuốc thử song song trên nền tảng Echo 555 và bằng thủ công. Bộ thao tác chất lỏng Echo sử dụng một cài đặt loại chất lỏng duy nhất sử dụng Phân tích chất lỏng động, điều chỉnh mức năng lượng sóng âm trong thời gian thực để truyền các loại chất lỏng khác nhau từ một tấm nguồn duy nhất.
Phương pháp
Một tấm nguồn đủ tiêu chuẩn Echo bằng polypropylen 384 giếng chứa đầy 30 μL thuốc thử Crystal Screen HT, 30 μL lysozyme (Hampton Research, HR7-108, 50 mg/mL trong natri axetat trihydrat 0,02 M, pH 4,6) và 30 μL thaumatin (Sigma, T7638, 25 mg/mL trong 0,1 M ADA, pH 6,5). Tấm này được ly tâm trước khi sử dụng.
Hệ thống Echo 555 được sử dụng để truyền thuốc thử sàng lọc protein và tinh thể theo tỷ lệ 1:1 từ tấm nguồn sang giếng thả với tổng thể tích là 50 nL và 100 nL. Protein được chuyển đầu tiên, tiếp theo là thuốc thử sàng lọc. Các tấm ngay lập tức được niêm phong và kiểm tra bằng mắt để xác minh sự kết tụ của giọt. Một đĩa bổ sung được tạo ra bằng cách trộn thủ công tỷ lệ 1:1 của thuốc thử sàng lọc protein và tinh thể đến thể tích cuối cùng là 1 µL. Các đĩa được ly tâm trong một phút ở tốc độ 1500 vòng/phút và ủ ở nhiệt độ phòng.
Kết quả
Sự kết tinh đã được quan sát thấy đối với cả hai loại protein (Hình 4). Các điều kiện kết tinh và dạng tinh thể nhất quán giữa các tấm được chuẩn bị thủ công và các tấm được chuẩn bị bằng Bộ thao tác chất lỏng Echo, ngay cả ở thể tích giảm đối với các tấm được chuẩn bị bằng Bộ thao tác chất lỏng Echo. Một thuốc thử tạo ra tinh thể hình khối 3-D với lysozyme; một tinh thể dạng cluster khác được tạo ra. Tinh thể thaumatin 3-D được tạo ra bằng thuốc thử khác.
Thí nghiệm 3
Độ lặp lại của các thử nghiệm kết tinh
Ba điều kiện kết tinh trong Thí nghiệm 2 được thực hiện lặp lại nhiều lần để xác nhận rằng kết quả kết tinh có thể lặp lại.
Phương pháp
Việc lặp lại một phần và toàn bộ đĩa được thực hiện trên các đĩa Swissci 96 giếng với các điều kiện sau: 1) 50 mg/mL lysozyme + thuốc thử Crystal Screen HT E1 (natri clorua 2,0 M, 10% w/v polyethylene glycol 6.000), 2) 50 mg/mL lysozyme + Thuốc thử Crystal Screen HT E9 (natri axetat trihydrat 0,1 M, natri clorua 2 M), 3) dung dịch thaumatin 25 mg/mL + thuốc thử Crystal Screen HT C5 (natri HEPES 0,1 M, pH 7,5, kali 0,8 M natri tartrat tetrahydrat).
Các thử nghiệm được thực hiện với thể tích nhỏ giọt 50 nL và 100 nL (được truyền bằng hệ thống Echo 555), cũng như thể tích giọt 1 μL, được truyền thủ công. Đối với các tấm Echo, 10 μL thuốc thử tương ứng được thêm vào giếng chứa; 25 µL đối với các đĩa được chuẩn bị thủ công. Sau khi truyền thuốc thử và protein, các đĩa được đậy kín và ly tâm, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng.
Kết quả
Cả ba phương pháp đều cho thấy độ lặp lại tốt đối với ba thử nghiệm kết tinh khác nhau. Trong hai trường hợp, thể tích nhỏ giọt 100 nL được truyền trên Hệ thống Echo 555 cho thấy khả năng tái tạo cao hơn một chút so với thể tích lớn hơn được chuẩn bị bằng thủ công
Thí nghiệm 4
Truyền các thành phần thuốc thử tinh thể đậm đặc
Việc chuyển lượng dự trữ nồng độ cao của các thành phần thuốc thử tinh thể thông thường khác nhau đã được thử nghiệm để xác định độ chính xác của việc truyền với một loại chất lỏng phổ biến duy nhất.
Phương pháp
Dung dịch các thành phần thuốc thử tinh thể học ở các nồng độ khác nhau được pha tạp natri fluorescein đến nồng độ cuối cùng là 0,15 mM. Mỗi mẫu được nạp vào một tấm nguồn polypropylen đủ tiêu chuẩn Echo 384 giếng với thể tích từ 20-50 μL. 50 nL của mỗi dung dịch được chuyển từ đĩa nguồn bằng Bộ thao tác chất lỏng Echo sang đĩa đích (Greiner Bio-One). Thêm 50 µL dung dịch NaOH 10 mM, pH 12. Các đĩa được ly tâm, ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó đọc trên máy đọc đĩa BioTek Synergy H4.
Kết quả
| Thành phần thuốc thử | Conc. | CV |
| PBS | 1x | 1,91% |
| Dạng muối natri | 1 triệu | 3,37% |
| Natri axetat | 3 triệu | 4,73% |
| Amoni sunfat | 2 triệu | 3,28% |
| NaCl | 5 triệu | 2,17% |
| Liti sunfat | 2,5 triệu | 1,82% |
| Tris | 4,17 triệu | 1,73% |
| HEPES | 2,42 triệu | 2,67% |
| Amoni Nitrat | 2 triệu | 2,31% |
| Amoni Nitrat | 4 triệu | 2,53% |
| Amoni Nitrat | 6 triệu | 2,22% |
| Amoni Nitrat | 7 triệu | 2,42% |
| Thành phần thuốc thử | Conc. | CV |
| PEG 3.350 (có/v) | 30% | 2,01% |
| PEG 3.350 (có/v) | 35% | 3,78% |
| PEG 8.000 (w/v) | 12% | 1,48% |
| PEG 8.000 (w/v) | 15% | 1,64% |
| PEG 8.000 (w/v) | 18% | 1,45% |
| PEG 8.000 (w/v) | 21% | 1,79% |
| PEG 20.000 (w/v) | 5% | 2,60% |
| PEG 20.000 (w/v) | 7,5% | 2,07% |
| PEG 20.000 (w/v) | 10% | 2,10% |
| Isopropanol (v/v) | 10% | 4,66% |
| MPD (v/v) | 10% | 7,72% |
| MPD (v/v) | 20% | 6,15% |
| MPD (v/v) | 30% | 5,66% |
Bảng 1: Dữ liệu CV để chuyển các thành phần dung dịch tinh thể nồng độ cao khác nhau trên bộ xử lý chất lỏng Echo. (n=2; dữ liệu MPD là n=3)
Thí nghiệm 5
Tạo thuốc thử kết tinh từ các thành phần có nồng độ cao
Với khả năng truyền các thành phần thuốc thử tinh thể học có nồng độ cao đã được xác nhận, một nỗ lực đã được thực hiện để tái tạo các điều kiện tinh thể học bằng cách thiết lập lại điều kiện kết tinh ban đầu trong thời gian chạy. Vì thuốc thử gốc đậm đặc có thể được vận chuyển một cách chính xác bằng Bộ thao tác chất lỏng Echo nên có thể sẽ thu được kết quả kết tinh tương tự. Trong trường hợp này, dung dịch Hampton Crystal Screen E9 (natri clorua 2 M và natri axetat trihydrat 0,1 M, độ pH 4,6) là điều kiện được tái tạo, tạo ra các tinh thể cluster từ lysozyme 50 mg/mL.
Phương pháp
Các giếng trong đĩa nguồn đủ tiêu chuẩn Echo gồm 384 giếng được đổ đầy 30 μL 5 M natri clorua, 30 μL 0,5 M natri axetat, độ pH 4,6, 30 μL nước, 30 μL dung dịch Crystal Screen E9 (natri clorua 2 M, natri 0,1 M axetat trihydrat, pH 4,6) từ Hampton (P/N HR2-912-14) và 30 μL 50 mg/mL lysozyme trong natri axetat trihydrat 0,02 M, đệm pH 4,6. Đĩa nguồn được ly tâm và đặt trong nền Echo 555 để chuyển 20 nL natri clorua, 10 nL natri axetat và 20 nL nước vào các giếng nhỏ của nửa đĩa Swissci (hàng AD, 48 giếng) để tạo ra dung dịch natri clorua 2 M, natri axetat 0,1 M, pH 4,6 trong các giếng đó. Sau đó, 50 nL thuốc thử Hampton Crystal Screen E9 được chuyển vào các giếng nhỏ ở nửa còn lại (hàng EH, 48 giếng) của cùng một đĩa. Sau đó, 50 nL lysozyme được truyền vào các giếng giống nhau trên toàn bộ đĩa. Sau đó, đĩa được đậy kín, ly tâm trong 1 phút ở tốc độ 1500 vòng/phút và ủ ở nhiệt độ phòng. Các giếng chứa trong đĩa Swissci đã được đổ đầy trước 10 μL dung dịch E9 trước bước chuyển trên Bộ thao tác chất lỏng Echo.
Kết quả
Các tinh thể dạng cluster, như được thấy trong mảng ban đầu (xem Hình 3), được quan sát thấy ở 36 trong số 48 giếng có thuốc thử E9. Các cluster cũng được quan sát thấy ở 41 trong số 48 giếng chứa dung dịch natri clorua 2 M, natri axetat 0,1 M được thực hiện nhanh chóng. Không thể thấy sự khác biệt rõ ràng giữa các tinh thể được hình thành bằng hai dung dịch, như trong Hình 6.
Thí nghiệm 6
Tạo lưới tinh thể
Sau khi tái tạo thành công thuốc thử tinh thể học trên Bộ thao tác chất lỏng Echo bằng cách sử dụng các dung dịch thành phần có nồng độ cao hơn, bước tiếp theo là tạo ra lưới tinh thể lysozyme lớn hơn dựa trên các điều kiện ban đầu trong Thí nghiệm 5.
Phương pháp
30 µL dự trữ natri clorua nồng độ cao (4, 4,25, 4,5, 4,7 và 5 M), natri axetat, pH 4,6 (2 M) và polyethylen glycol 3.350 (20% w/v) được nạp vào máy 384- tấm nguồn đủ tiêu chuẩn Echo, cùng với nước và lysozyme 50 mg/mL. Mỗi thành phần phi protein được chuyển trên nền tảng Echo 555 với thể tích khác nhau đến thể tích cuối cùng là 50 nL, tạo ra ma trận có các điều kiện tinh thể học khác nhau (Hình 7). 50 nL lysozyme sau đó được chuyển vào các giếng tương tự. Các giếng chứa của đĩa được đổ đầy trước 10 μL dung dịch natri clorua 2 M, natri axetat 0,1 M, pH 4,6, dung dịch PEG 3.350 10% w/v. Sau khi chuyển trên nền Echo 555, đĩa được đậy kín, ly tâm ở tốc độ 1500 vòng/phút trong 1 phút và ủ ở nhiệt độ phòng.
Kết quả
Các tinh thể cluster được quan sát thấy ở một số giếng như được quan sát thấy trong các điều kiện ban đầu (Hình 6), và các tinh thể hình khối 3-D được quan sát thấy ở các giếng khác (Hình 8).
Tóm tắt
Hệ thống Echo 500 đã tối ưu việc truyền chất lỏng bằng cách sử dụng năng lượng sóng âm để đẩy chất lỏng. Bộ xử lý chất lỏng Echo hoàn toàn không tiếp xúc—không có đầu hoặc vòi phun và không có vật liệu nào tiếp xúc với mẫu khi mẫu di chuyển từ nguồn đến đích. Thể tích thấp, truyền chính xác ở thể tích từ 2,5 nL trở lên. Việc giảm thể tích làm giảm mức tiêu thụ protein và thuốc thử trong các thử nghiệm kết tinh. Phân tích chất lỏng động cho phép chuyển protein và về cơ bản là tất cả các lưới tinh thể bằng cách sử dụng một cài đặt lớp chất lỏng duy nhất, giúp loại bỏ nhu cầu cài đặt nhiều lần hoặc hiệu chuẩn thường xuyên. Việc chuyển mẫu từ bất kỳ giếng nguồn nào đến bất kỳ đích nào sẽ giảm thiểu mức tiêu thụ mẫu và đơn giản hóa việc thiết lập và thực hiện xét nghiệm.
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các Máy thao tác chất lỏng hãng Beckman Coulter.
EN