Nguyên tắc cơ bản của quá trình Siêu ly tâm tinh sạch vi rút (Ultracentrifugal Virus Purification)

Siêu ly tâm

Trường Cao học Khoa học Y sinh Đại học Nagasaki

Dịch tễ học phân tử

Giáo sư: Tiến sĩ Osamu Nakagomi

Trong những năm gần đây, trong nghiên cứu vi rút, việc tinh sạch và phân tích bộ gen cũng như xác định vi rút từ các mẫu bằng thiết bị ly tâm đã trở thành thông lệ tiêu chuẩn. Bởi vì nghiên cứu trước đây đã xác định loại vi-rút nào có bộ gen nào, nên việc xác định vi-rút có thể thực hiện được ngay cả khi ở trạng thái hỗn hợp. Tuy nhiên, để nghiên cứu bộ gen nào có trong hạt virus nhằm nghiên cứu chi tiết về bản chất của virus, trước tiên cần phải tinh sạch các hạt virus đến mức độ tinh khiết cao. Beckman Coulter cũng đang nhận được ngày càng nhiều câu hỏi yêu cầu cung cấp thông tin chi tiết về phương pháp Siêu ly tâm tinh sạch vi rút, vì vậy chúng tôi đã hỏi Tiến sĩ Osamu Nakagomi, giáo sư tại Đại học Nagasaki, người có kiến ​​thức sâu rộng về phân tích vi rút bằng phương pháp siêu ly tâm, về các Nguyên tắc cơ bản của quá trình này.

Nhà khoa học - Nguyên tắc cơ bản về thanh lọc virus

Dưới đây là những câu hỏi xoay quanh vấn đề Siêu ly tâm tinh sạch vi rút dành cho giáo sư:

Giới thiệu của giáo sư

Chuyên môn của tôi là dịch tễ học phân tử của rotavirus. Cho đến những năm 1970, nguyên nhân gây tiêu chảy ở trẻ sơ sinh hầu như chưa được biết rõ, kể cả liệu có liên quan đến virus hay không. Với việc phát hiện ra rotavirus vào năm 1973, người ta phát hiện ra rằng rotavirus là nguyên nhân khiến một nửa số bệnh nhân nhập viện nhi khoa vì tiêu chảy. Vắc xin đã được hoàn thiện vào năm 2006 sau nhiều biến chứng và được đưa vào sử dụng từ năm 2011. Hiện nay, câu hỏi có nên tiến hành tiêm chủng định kỳ hay không đang được Bộ Y tế, Lao động và Phúc lợi nghiên cứu.

Rotavirus là một loại virus không có vỏ bọc có bộ gen bao gồm RNA sợi đôi với 11 đoạn (Hình 1). Giống như các loại virus RNA khác, nó tiến hóa nhanh chóng và do tính đa dạng gen phong phú, nó lây nhiễm không chỉ cho con người mà còn nhiều loại động vật có vú và chim. Vào những năm 1980, lần đầu tiên sử dụng các phương pháp dịch tễ học phân tử ở cấp độ gen, chúng tôi đã phát hiện ra rằng rotavirus ở động vật có thể gây bệnh và có thể lây nhiễm sang người. Chứng minh cách rotavirus tiến hóa trong khi nó sử dụng con người và các động vật khác làm vật chủ – và cách thức lây nhiễm – là cốt lõi trong nghiên cứu của chúng tôi. Chúng tôi cũng đang điều tra những thay đổi nào sẽ xảy ra khi sử dụng vắc xin. Loại nghiên cứu này thuộc lĩnh vực dịch tễ học phân tử, nghiên cứu bộ gen của virus

Nguyên tắc cơ bản về thanh lọc tế bào - virus

Hình 1. Cấu trúc hạt Rotavirus và bộ gen RNA. Trái: Hạt nguyên vẹn có lớp vỏ ngoài làm bằng protein màu đỏ và xanh lam và có cấu trúc ba lớp nên gọi là hạt ba lớp (TLP); nếu lớp vỏ bên ngoài bị bong ra thì vẫn còn lại hạt hai lớp (DLP) có protein màu xanh lam. Phải: RNA bộ gen của rotavirus được tách thành 11 đoạn với các mẫu đặc trưng được thể hiện bằng điện di. Sơ đồ của hạt rotavirus được cung cấp bởi Giáo sư Prasad của Đại học Baylor.

Hãy thảo luận về sự cần thiết của siêu ly tâm

Khi trích xuất bộ gen virus bằng phương pháp cổ điển, trước tiên các hạt virus phải được tinh  sạch. Sau đó, bộ gen virus được chiết xuất từ ​​​​các hạt được phân tích. Siêu ly tâm tinh sạch vi rút đóng một vai trò quan trọng trong quá trình này. Việc tinh sạch các hạt vi rút có thể đảm bảo rằng chúng ta đang giải quyết mối nghi ngờ rằng bộ gen có trong các hạt rotavirus. Tuy nhiên, nếu chúng ta đang giải quyết vấn đề xác định loại cơ quan tế bào chủ hoặc protein và bộ gen của virus được tập hợp trong một tế bào bị nhiễm bệnh thì siêu ly tâm trở nên cần thiết.

Hơn nữa, khi nghiên cứu các loại virus mới cần phải điều tra xem trong hạt virus có bộ gen hay không. Trong những trường hợp như vậy, việc tinh sạch siêu ly tâm là cần thiết. Thông tin về mật độ nổi, kích thước và bộ gen rotavirus trong các hạt virus. Hiện tại, việc phân tích hầu như luôn được thực hiện sau khi trích xuất bộ gen một cách vội vàng mà không làm sạch mẫu vật. Điều này là do loại bộ gen có trong hạt rotavirus đã được biết đến và tiền đề cơ bản là nếu có đặc điểm bộ gen (Hình 1, bên phải) của rotavirus thì sẽ không có hệ số lắng đọng (giá trị Svedberg, giá trị S) , liên quan đến siêu ly tâm, là nền tảng chính của virus học. Thông tin cơ bản này được gọi là đặc tính hóa lý của virus.

Xin vui lòng cho chúng tôi một phác thảo về Siêu ly tâm tinh sạch vi rút

Khi tinh sạch rotavirus khỏi bệnh nhân, chúng ta phải tách các bào quan tế bào, đại phân tử sinh học và những thứ tương tự khỏi virus. Những hạt này có kích thước và mật độ khác nhau. Quá trình Siêu ly tâm tinh sạch vi rút tận dụng những khoảng trống mà các hạt khác không thể đi vào bằng cách sử dụng kết hợp “ly tâm gradient mật độ sucrose, bị ảnh hưởng bởi giá trị S của các hạt” và “ly tâm cân bằng gradient mật độ Caesium clorua (siêu ly tâm cân bằng mật độ), trong đó bị ảnh hưởng bởi mật độ nổi của các hạt trong dung môi.” Hình 2 cho thấy mối quan hệ giữa mật độ dải (mật độ tại đó các dải xuất hiện trong quá trình ly tâm gradient mật độ) và giá trị S. Virus nằm chính xác trong các khoảng trống giữa nhiều loại hạt tế bào, bao gồm cả microsome và ribosome. Virus là phức hợp của protein (chủ yếu có mật độ nổi 1,3 g/cm3) và axit nucleic (chủ yếu có mật độ nổi 1,7 g/cm3), do đó mật độ nổi là 1,35–1,4 g/cm3. Mặt khác, kích thước của vi rút đạt giá trị S là 100–1.000 S. Giá trị S của các phân số microsome trùng với giá trị của vi rút (trục ngang), nhưng có thể phân tách theo mật độ (trục tung). Do đó, quá trình phân tách được thực hiện bằng cách ly tâm gradient mật độ của sucrose, Xesi clorua, và các chất tương tự. Các phân đoạn virus có mật độ cao hơn các phân đoạn microsome vì chúng bao gồm axit nucleic. Hơn nữa, virus càng lớn thì giá trị S của nó càng lớn. Siêu ly tâm bao gồm quá trình tinh sạch bằng cách kết hợp hai thông số này, do đó rõ ràng là nó thích hợp với các đặc tính hóa lý.

Máy ly tâm cũng cực kỳ quan trọng để cải thiện cảm nhận trực tiếp của chúng ta về các đặc tính hóa lý này. Kích thước cũng có thể được quan sát một cách đáng tin cậy bằng kính hiển vi điện tử, nhưng nếu xuất hiện một chủng vi rút mới, việc xác định vị trí vi rút sẽ rơi khi ly tâm là rất quan trọng. Ví dụ, cúm và rotavirus, có kích thước vừa phải, ở mức 100 nm, sẽ giảm xuống nếu quay qua đêm trong khoảng hơn 10.000 vòng quay bằng máy ly tâm tốc độ cao Avanti. Tuy nhiên, norovirus có kích thước khoảng 30 nm, vì vậy nó sẽ không bị loại bỏ bằng máy ly tâm Avanti và do đó thiết bị siêu ly tâm Optima sẽ là lựa chọn cần thiết. Để làm cho các hạt 30 nm rơi xuống bằng máy ly tâm Avanti, quá trình tinh sạch được thực hiện sau khi giảm thể tích bằng phương pháp như tủa muối.

Ngoài ra, liên quan đến các phương pháp thể tích quy trình, từ yêu cầu thể tích lớn nhất đến nhỏ nhất, bao gồm: ly tâm vi sai (ép viên thông thường); phương pháp đệm; phương pháp gradient mật độ Phương pháp đệm cho phép đổ đầy mẫu vào ống từ 60–70%, nhưng thể tích sẽ vào khoảng 10–15% đối với quá trình ly tâm gradient mật độ. Do đó, sau khi xác định các đặc tính hành vi của các hạt bằng phương pháp gradient mật độ, phương pháp đệm được sử dụng để cho phép xử lý khối lượng lớn hơn. Ví dụ, hạt rotavirus đi qua lớp sucrose 30%, nhưng không xuyên qua lớp sucrose 70%, do đó virus có thể tập trung ở ranh giới giữa các lớp sucrose 30% và 70% (Hình 3).

Graph- Nguyên tắc cơ bản về thanh lọc virus
Hình 2.   Mật độ virus/cơ quan và giá trị S1

Vui lòng cho chúng tôi biết về quá trình Siêu ly tâm tinh sạch vi rút đối với loại vi rút cụ thể

Rôto góc cố định và rôto xoay

Nói chung, nếu so sánh các rôto tạo ra cùng một lực ly tâm thì rôto góc cố định cho phép xử lý khối lượng lớn hơn và dễ sử dụng hơn. Tuy nhiên, nếu vấn đề làm sạch là mối lo ngại chính thì nên sử dụng rôto xoay có nắp để loại bỏ sạch các dải được tạo ra bằng quá trình ly tâm gradient mật độ.

Chuẩn bị mẫu để ly tâm thô

Tôi sẽ giải thích bước chuẩn bị mẫu bằng cách tinh sạch rotavirus từ môi trường nuôi cấy làm ví dụ. Do mối quan hệ về năng suất, nếu bạn muốn tách vi-rút khỏi môi trường nuôi cấy, thể tích ban đầu phải là khoảng 1 L. Do đó, sau một mức độ cô đặc nhất định bằng máy ly tâm tốc độ cao, bước cô đặc và tinh sạch sẽ được thực hiện. Máy siêu ly tâm đặt sàn sử dụng rôto xoay SW 32 Ti hoặc SW 55 Ti. Theo tôi, SW 32 Ti là một chiếc “rotor lý tưởng” với thiết kế cực kỳ dễ sử dụng. Chúng tôi sử dụng rôto này trong máy siêu ly tâm Optima của Beckman Coulter Life Sciences. Tôi đánh giá Optima là giải pháp đáng tin cậy trong phòng thí nghiệm, đặc biệt là khi dùng để chạy mẫu qua đêm.

Hình 3 cho thấy quy trình tinh sạch rotavirus khỏi môi trường nuôi cấy. Đầu tiên, để loại bỏ các mảnh tế bào, chia 1 L môi trường nuôi cấy vào sáu chai và ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 15.000 xg bằng rôto góc cố định JA-14. Bước này có thể được bỏ qua, nhưng sẽ có nhiều tạp chất hơn trong quá trình siêu ly tâm sử dụng phương pháp đệm ở giai đoạn tiếp theo. Càng áp dụng nhiều tiền xử lý thì các hoạt động tiếp theo càng trở nên dễ dàng và sạch sẽ hơn. Hơn nữa, nếu có một lượng lớn tạp chất, vi rút sẽ bám vào chúng, điều này có thể làm giảm năng suất.

Tiếp theo, lấy phần nổi phía trên cùng với các mảnh tế bào được loại bỏ bằng cách ly tâm trong 14–16 giờ ở tốc độ 30.000 xg bằng rôto góc cố định JA-14. Ngoài ra, bạn có thể sử dụng máy siêu ly tâm và xử lý 300 mL mỗi lần bằng rôto góc cố định Loại 45 Ti. Có thể ly tâm nhanh các mẫu này ở tốc độ 30.000 vòng/phút/2 giờ hoặc 40.000 vòng/phút/1,5 giờ.

Tiếp theo, hòa tan các viên trong 26 mL dung dịch muối đệm phốt phát (PBS). Theo nguyên tắc chung, không nên sử dụng nồng độ cao hơn 1 đến 10 trong một bước duy nhất. Ví dụ: nếu thể tích ban đầu là 1 L, không nên cô đặc xuống dưới 100 mL; nếu tập trung đến 10 mL, kết quả dẫn đến dung dịch hòa tan sẽ bị đục.

Sơ đồ 2- Nguyên tắc cơ bản về thanh lọc virus

Hình 3.   Tinh chế rotavirus

Phương pháp siêu ly tâm tinh sạch 

Tiếp theo, loại bỏ tạp chất bằng phương pháp đệm sucrose bằng Rotor xoay SW 32 Ti công suất lớn. Các hạt rotavirus có thể tập trung ở ranh giới giữa 30% và 70% sucrose. Đặt 4,5 mL dung dịch sucrose 70% vào đáy ống siêu ly tâm 38,5 mL, phủ 6,5 mL dung dịch sucrose 30% lên trên, sau đó phủ 26 mL huyền phù virus, lơ lửng trong PBS lên trên. Nếu xử lý siêu ly tâm được áp dụng theo các điều kiện trong Hình 3, các tạp chất sẽ tích tụ với số lượng lớn trên dung dịch sucrose 30% và các hạt rotavirus sẽ tích tụ trong khoảng từ 70% đến 30%. Thu thập dải trung gian màu trắng này. Điều này có thể được thực hiện theo ba cách: sử dụng ống tiêm rút nó ra; thu thập dải yêu cầu sau khi loại bỏ chất lỏng không cần thiết ở trên; hoặc tách các phân số bằng cách chèn kim từ bên dưới.

Để tăng thêm mức độ tinh khiết, hãy thực hiện ly tâm gradient mật độ bằng cách sử dụng Rôto xoay SW 32 Ti công suất nhỏ. Đặt dung dịch xêsi clorua 55% (w/v) vào đáy ống siêu ly tâm 5 mL và sau đó phủ cùng một lượng dung dịch xêsi clorua 40% (w/v) lên trên. Sự phân cấp mật độ được tạo ra bằng cách phân lớp các giải pháp có mật độ khác nhau và quy trình này thường tốn thời gian. Tuy nhiên, có thể thực hiện được gradient mật độ ngay cả khi chỉ có hai lớp. Lớp 0,5–0,8 mL phần thô virus thu được bằng phương pháp đệm (tốt hơn là sử dụng một lượng nhỏ dung dịch trong trường hợp này) trên dung dịch Caesium clorua đã được phân lớp và thực hiện siêu ly tâm trong 16–20 giờ ở 257.000 x g.

Như bạn có thể thấy trong Hình 3, có hai dải rotavirus có thể nhìn thấy được. Dải trên là rotavirus nguyên vẹn 1,36 g/cm3 (hạt ba lớp: TLP) và dải dưới là rotavirus 1,38 g/cm3 đã loại bỏ lớp vỏ bên ngoài (hạt hai lớp: DLP). Các hạt virus chứa RNA. DLP có ít protein và tỷ lệ axit nucleic cao hơn. Dải màu xanh phía trên là các hạt rỗng chỉ bao gồm các protein không có axit nucleic và vì chúng là protein nên mật độ nổi là khoảng 1,3 g/cm3. Trên thực tế, khi phần bên ngoài của TLP được loại bỏ để lộ DLP, RNA polymerase sẽ được kích hoạt. Trong các thí nghiệm liên quan đến RNA polymerase, rotavirus DLP đã được loại bỏ phần bên ngoài được sử dụng.

Làm sạch rôto 

Khuyến nghị: Vì sử dụng xêsi clorua mật độ cao nên hãy rửa kỹ rôto bằng nước ấm sau khi sử dụng để tránh bị ăn mòn.

Nhóm nhà khoa học - Nguyên tắc cơ bản về thanh lọc virus
Nhóm nhà khoa học của Phòng thí nghiệm Dịch tễ học phân tử

Nguồn: https://www.beckman.com/resources/reading-material/case-studies/virus-purification-fundamentals

Minh Khang là nhà nhập khẩu và phân phối trực tiếp các thiết bị ly tâm hãng Beckman Coulter.