Siêu ly tâm quay mẫu ở tốc độ cao để phân tách lực g cao. Máy siêu ly tâm quay các mẫu từ 100.000 x g đến 1.000.000 x g và được sử dụng để tinh chế và mô tả các polyme có trọng lượng phân tử thấp cho đến các phức hợp và bào quan protein đa megaDalton.
Vật lý đằng sau công nghệ siêu ly tâm
Lực ly tâm ảnh hưởng đến tất cả các hạt trong quá trình ly tâm. Các hạt tách ra nhanh như thế nào tùy thuộc vào mức độ của lực này (tức là tốc độ quay của máy ly tâm), tính chất vật lý của các hạt (ví dụ: khối lượng, kích thước, hình dạng), độ nhớt và mật độ của môi trường.
Bằng cách điều khiển tốc độ ly tâm, độ nhớt trung bình và mật độ trung bình, quá trình ly tâm có thể thực hiện một số quá trình phân tách cực kỳ khó khăn. Qua nhiều thập kỷ sử dụng máy ly tâm, nhiều kỹ thuật khác nhau đã được phát triển để hoàn thành quá trình phân tách cụ thể.
v = tốc độ hạt
d = đường kính hạt hình cầu
Pp = Mật độ hạt
Pf = Mật độ chất lỏng
ŋ = độ nhớt chất lỏng
g = tốc độ trái đất
Kỹ thuật ly tâm
Ép viên và ly tâm vi sai
Ép viên là một trong những kỹ thuật ly tâm phổ biến nhất. Các hạt lắng ra khỏi dung dịch và bám vào thành bình do lực ly tâm. Sau khi gạn, phần nổi phía trên sẽ được tách ra khỏi viên. Ly tâm vi sai khai thác thực tế là các hạt khác nhau được tạo thành viên ở các tốc độ khác nhau dựa trên kích thước, hình dạng và mật độ của chúng. Bằng cách lặp đi lặp lại việc tạo hạt và tách mẫu trong nhiều lần chạy ly tâm, quá trình ly tâm vi sai có thể cô lập các vật liệu ngày càng nhỏ ra khỏi hỗn hợp.
Một số phần hao hụt của viên nén có thể được quan sát. Điều này là do sự cân bằng giữa quá trình lắng đọng và khuếch tán—chất này không hoàn toàn ở dạng viên và được khuếch tán một phần trong phần nổi phía trên.
Nếu tách ra khỏi viên có thể làm thất thoát các thành phần liên quan. Để tránh điều này xảy ra, quá trình ly tâm phải được thực hiện ở giá trị g lớn nhất có thể , nhiệt độ thấp nhất có thể và phanh càng nhanh càng tốt.
Ly tâm vi sai tạo ra kết quả đáng tin cậy nếu hệ số lắng của hạt được phân biệt theo ít nhất một hệ số ba. Một ví dụ điển hình của ly tâm vi sai là tạo hạt cho màng tế bào hoặc phân lập một EV cụ thể.
Tỷ lệ ly tâm khu vực
Tốc độ ly tâm theo vùng được hưởng lợi từ lợi thế của gradient tỷ trọng—một cột chất lỏng có tỷ trọng tăng theo chiều dài của ống. Mẫu được xếp thành lớp ở đầu ống phía trên một gradient được tạo sẵn.
Giống như khi ép viên, các mẫu được phân tách bằng hệ số lắng (yếu tố kích thước, hình dạng và mật độ nổi). Tuy nhiên, trong quá trình ly tâm theo vùng tốc độ, quá trình chạy máy ly tâm bị dừng lại trước khi các hạt kết thành hạt và các thực thể khác nhau được xem là các dải trong ống. Các dải gần đáy ống nhất có hệ số lắng đọng cao hơn các dải phía trên chúng.
Các hạt có kích thước và khối lượng tương tự di chuyển với tốc độ hơi khác nhau. Để vẫn đạt được sự phân tách tốt, (1) tăng độ nhớt của môi trường hoặc (2) sử dụng ống có chiều dài đường truyền dài hơn (tương tự như sắc ký loại trừ kích thước hoặc điện di trên gel); rô-to văng cung cấp chiều dài đường dẫn dài để đáp ứng nhu cầu này.
Cuối cùng, các thí nghiệm theo vùng tỷ lệ thường bắt đầu với một mẫu cô đặc trong một thể tích nhỏ (thường là 10-20% so với thể tích của tổng gradient). Sử dụng một lượng mẫu nhỏ sẽ giảm thiểu sự khác biệt về điểm bắt đầu khi bắt đầu chạy. Ngược lại, mẫu càng lớn thì sự khác biệt về điểm bắt đầu của các vật liệu được tách ra càng lớn. Lượng mẫu lớn hơn sẽ có các dải rộng hơn và ít phân tách dải hơn, điều này có thể khiến việc khôi phục mẫu nguyên chất trở nên khó khăn hơn. Nếu có sẵn, các ống rộng hơn cho phép tải mẫu lớn hơn
Ly tâm Isopycnic
Ở đầu kia của quang phổ, quá trình ly tâm isopycnic phân tách các vật liệu dựa trên mật độ biểu kiến (nổi) của chúng trong dung dịch. Điều quan trọng cần đề cập là mật độ nổi của vật liệu bao gồm mật độ của chất lỏng xung quanh mà tại đó vật liệu sẽ không nổi cũng như không lắng đọng; do đó, giá trị này không phải là một thuộc tính hạt nội tại và có thể thay đổi đáng kể trong các môi trường gradient khác nhau.
Mật độ nổi còn được gọi là đẳng mật độ hoặc mật độ cân bằng của hạt. Độ dốc isopycnic thường được hưởng lợi từ độ dài đường dẫn ngắn trong quá trình ly tâm (giúp giảm thiểu thời gian cần thiết để đạt được trạng thái cân bằng) và độ dài đường dẫn dài hơn ở trạng thái nghỉ sau khi độ dốc đã định hướng lại; điều này thường đạt được tốt nhất ở các rô-to thẳng đứng và gần thẳng đứng và được hỗ trợ thêm bởi các ống có tỷ lệ khung hình cao (chiều dài/chiều rộng).
Đối với quá trình phân tách isopycnic, các vật liệu gradient mật độ thường được sử dụng bao gồm:
- CsCl
- Percoll ®
- iodixanol
Chúng có chung đặc tính duy nhất là tạo ra dải mật độ gradient tự hình thành khi có các trường ly tâm đủ lớn và lực g được áp dụng sẽ ảnh hưởng đến hình dạng và phạm vi của gradient. Nhiệt độ và nồng độ ban đầu của vật liệu gradient mật độ cũng góp phần xác định gradient cuối cùng.
Trong quá trình ly tâm, các gradient này đạt đến trạng thái cân bằng, chủ yếu được ổn định nhờ sự cân bằng của lực ly tâm và sự khuếch tán. Khi đạt đến trạng thái cân bằng, cấu hình gradient không đổi vô thời hạn trong khi quay và các hạt trong dung dịch di chuyển để đạt đến điểm trong gradient phù hợp với mật độ nổi của chúng, còn được gọi là điểm đẳng nhiệt.
Sự phân tách chỉ xảy ra do sự khác biệt về mật độ của các hạt. Vì không có sự thay đổi nào đối với các gradient hình thành xảy ra khi thời gian ly tâm tăng lên, thời gian không phải là một yếu tố sau khi đã đạt được trạng thái cân bằng.
Bởi vì các gradient được sử dụng trong quá trình phân tách isopycnic tự hình thành nên không cần phải thêm mẫu vào đầu hoặc cuối của một gradient. Thay vào đó, vật liệu tạo gradient thường được khuấy trộn với mẫu và sau đó được nạp đồng đều vào ống ly tâm. Điều này có thể cho phép tải lượng mẫu lớn đặc biệt (lớn hơn 90% thể tích ống) và chuẩn bị gradient đơn giản đáng kể, đặc biệt là so với gradient phân lớp cho tỷ lệ vùng.
Trong một số trường hợp, các dải màu này vẫn có thể được xếp lớp theo cách thủ công để rút ngắn thời gian cần thiết để dải màu đạt đến trạng thái cân bằng và giảm hơn 75% tổng thời gian chạy trong khi vẫn duy trì khoảng cách lớn.
Quá trình hình thành máy ly tâm của Beckman Coulter
Beckman Coulter đã giới thiệu máy siêu ly tâm đầu tiên vào năm 1947. Cho đến nay, các dòng thiết bị này ngày càng cải tiến hơn mang đến những giải pháp về công nghệ ly tâm với tốc độ cực kỳ mạnh mẽ.
Được thiết kế như một giải pháp hoàn chỉnh từ ống dẫn đến rô-to đến máy ly tâm, sản phẩm ly tâm đa dạng đã mang đến sự vượt trội ở mọi góc độ.
Khám phá các dòng máy siêu ly tâm của Beckman Coulter
Nguồn: https://www.beckman.com/resources/technologies/centrifugation/ultracentrifugation
EN