Giải pháp ly tâm và đặc tính hạt của Beckman Coulter cho các ứng dụng công nghệ nano trong y học

Nanomedicine là một lĩnh vực phổ biến đối với các nhà hóa học, nhà khoa học vật liệu, nhà sinh học, kỹ sư y sinh và nhà khoa học y tế. Bài viết này nhằm mục đích cung cấp cho các nhà nghiên cứu cái nhìn sâu sắc về những hạn chế trong xét nghiệm độc tính tế bào và đưa ra đánh giá độc tính của các hạt nano.

Các nhà nghiên cứu cũng sẽ hiểu rõ hơn về cách thức cải thiện đáng kể độ chính xác và quy trình làm việc trong cả quá trình điều chế và đánh giá độc tính của hạt nano trong ống nghiệm bằng cách sử dụng các thiết bị ly tâm và mô tả đặc tính hạt của Beckman Coulter.

Bài viết này trình bày cách máy siêu ly tâm Optima MAX-XP của Beckman Coulter giảm thiểu thời gian loại bỏ các ống nano tổng hợp, trong khi Vi-CELL XR của Beckman Coulter cho phép định lượng độc tính tế bào khi có sự hiện diện các ống nano carbon đơn vách (SWCNT).

Ly tâm

Công nghệ nano Y sinh 

Công nghệ nano Y sinh là một lĩnh vực đang ở giai đoạn phát triển. Các hạt nano như ống nano carbon (CNT), chấm lượng tử (QĐ) và graphene có một số tính năng quang phổ độc đáo có các ứng dụng cụ thể trong phân phối thuốc và chụp ảnh in vivo. Vì các QD, graphene và CNT đều phát huỳnh quang nên có thể đạt được hình ảnh sâu hơn với độ nhạy tăng. Hình ảnh In vivo mang tín hiệu Raman red-shifted của CNTs. Graphene và CNTs cũng là những chất vận chuyển thuốc và liệu pháp quang nhiệt mạnh mẽ do khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh và diện tích bề mặt cao. Tuy nhiên, những tính chất này có thể gây ra thách thức trong việc mô tả độc tính của vật liệu nano đối với các nhà nghiên cứu.

Thử nghiệm độc tính tế bào trong ống nghiệm thường sử dụng vùng hấp thụ và huỳnh quang chồng lên nhau bởi sự hấp thụ và phát huỳnh quang của từng vật liệu nano này, điều này có thể dẫn đến kết quả sai lệch và không chính xác.

Hơn nữa, huỳnh quang, độ hấp thụ và độc tính của các vật liệu này đều bị thay đổi đáng kể khi chúng được tổng hợp lại với nhau, nghĩa là sai lệch hệ thống xảy ra trong các nghiên cứu độc tính so sánh tổng hợp và không tổng hợp. Quá trình ly tâm dài thường được sử dụng để loại bỏ các hạt nano tổng hợp. Ví dụ, CNTs phải trải qua 6 giờ ly tâm ở 22.000 xg để tạo thành cốt liệu dạng viên.

Chuẩn bị ống nano cacbon

Các ống nano carbon đơn vách (Sigma-Aldrich) và 0,2% 1, 2-distearoyl-phosphatidylethanolamine -methyl-polyethyleneglycol (DSPE-mPEG, trọng lượng phân tử 5 kDa, Laysan Bio) được trộn trong 10mL nước. Các ống nano carbon phân tán được làm sạch bằng công nghệ sóng siêu âm trong 30 phút, theo quy trình đã thiết lập trước đó.

5 mL SWCNT được ly tâm trong các ống ly tâm bằng polycarbonate có nắp hở (Beckman Coulter P/N 343778) ở 22°C, 55.000 RPM (~I31.000 xg) trong hai phút bằng rôto TLA-120.2 trong Máy siêu ly tâm Optima MAX-XP. 650µL dịch nổi phía trên được thu thập cẩn thận để tránh làm vỡ các khối kết tụ dạng viên.

Sử dụng Bộ lọc ly tâm 10 kDa, Amicon Ultra 0,5 mL (Millipore) với máy ly tâm siêu nhỏ Beckman Coulter Microfuge 20, nồng độ của SWCNT siêu ly tâm (UCF’d SWCNT) và SWCNT không ly tâm (SWCNT được tạo ra) đã được thực hiện.

Phép đo nồng độ được thực hiện bằng máy quang phổ UV-Vis-NIR (Mô hình, Thiết bị phân tử) và hệ số giảm khối lượng đã thiết lập của SWCNTs ở bước sóng 808nm là 46,5L/g*cm2 Nước khử ion được sử dụng để pha loãng SWCNTs của UCF đậm đặc và SWCNTs As-Made ở nồng độ 0,6 mg/mL, 0,3 mg/mL và 0,06 mg/mL.

Hình ảnh của SWCNT. Hình ảnh quang học của ống nano cacbon đơn vách (a) không ly tâm và (b) siêu ly tâm trong hai phút ở tốc độ 55.000 RPM (~131.000 xg). Lưu ý sự hiện diện của SWCNT tổng hợp, màu đen trong mẫu không được siêu ly tâm.
Hình 1: Hình ảnh quang học của ống nano cacbon đơn vách (a) không ly tâm và (b) siêu ly tâm trong hai phút ở tốc độ 55.000 RPM (~131.000 xg).

Xét nghiệm độc tính

24 giờ trước khi thêm ống nano, tế bào ung thư vú MCF-7 được mạ ở mật độ 0,08 x 106 mỗi giếng trong đĩa 24 giếng với 900µL RPMI/10% FBS (Invitrogen). Sử dụng một trong các giếng trước khi thêm ống nano, sự phát triển và khả năng tồn tại của tế bào đã được xác nhận. Vào ngày hôm sau, 100µL mẫu SWCNT được thêm vào các giếng.

Tổng cộng, có sáu nhóm SWCNT (n=2/nhóm):

  • 0,06 mg/mL UCF’d SWCNTs
  • 0,06 mg/mL SWCNT As-Made
  • 0,03 mg/mL UCF’d SWCNTs
  • 0,03 mg/mL SWCNT As-Made
  • 0,006 mg/mL UCF’d SWCNTs
  • và 0,006 mg/mL SWCNT As-Made.

Để kiểm soát, 100µL mẫu DSPE-mPEG duy nhất được thêm vào các giếng.

Tổng cộng, có ba nhóm kiểm soát chất đệm chất hoạt động bề mặt (n=2/nhóm):

  • DSPE-mPEG 0,2 mg/mL;
  • 0,02 mg/mL DSPE-mPEG;
  • 0,002 mg/mL DSPE-mPEG.

Cuối cùng, đối chứng 1 (n=1) là đối chứng hoàn chỉnh, với các tế bào không bị ảnh hưởng và 100µl nước khử trùng được thêm vào đối chứng 2 (n=1). Sau 24 giờ, để có thể đếm trong Vi-CELL XR, tất cả các giếng được tráng bằng PBS, sau đó trypsin hóa và trộn trong 1mL PBS. Để giảm thiểu các ống nano tổng hợp được tính là tế bào, một loại tế bào mới đã được phát triển bằng phần mềm Vi-CELL XR. So sánh khả năng tồn tại của tế bào và sự khác biệt trong hai giải pháp được thực hiện bằng cách sử dụng tỷ lệ phần trăm của các tế bào khả thi.

Hình ảnh tế bào. Các tế bào MCF-7 được chụp ảnh dưới kính hiển vi quang học sau 24 giờ ủ với SWCNT. Các tế bào, được ủ với SWNT As-Made 0,06 mg/mL (hình ảnh bên trái) hoặc SWNT siêu ly tâm 0,06 mg/mL (hình ảnh bên phải), vẫn chưa đạt đến điểm hợp lưu. Các tập hợp màu đen của SWNT có thể được nhìn thấy trong hình ảnh bên trái; những tập hợp này rất khó bị rửa trôi nếu không rửa sạch cả tế bào. Các tập hợp có đặc tính hấp thụ và phát huỳnh quang sẽ làm sai lệch các xét nghiệm độc tính truyền thống.
Hình 2: Các tế bào MCF-7 được chụp ảnh dưới kính hiển vi quang học sau 24 giờ ủ với SWCNT.
Kết quả khả thi. Ở mọi nồng độ, SWCNT siêu ly tâm (được chỉ định bởi UC) có độc tính tối thiểu; 75% hoặc nhiều hơn các tế bào MCF-7 vẫn tồn tại trong 24 giờ sau khi ủ. Ngược lại, SWCNT không được ly tâm và chứa các loài tổng hợp (được chỉ định bởi AG) có độc tính ngày càng tăng đối với các tế bào MCF-7 được điều chỉnh theo tỷ lệ tăng dần. Ở nồng độ gốc là 0,6 mg/mL, tương ứng với nồng độ trong dung dịch có tế bào là 0,06 mg/mL, SWCNTs tổng hợp có tỷ lệ chết tế bào lớn hơn 50%.
Hình 3: Ở mọi nồng độ, SWCNT siêu ly tâm (được chỉ định bởi UC) có độc tính tối thiểu; 75% hoặc nhiều hơn các tế bào MCF-7 vẫn tồn tại trong 24 giờ sau khi ủ.

Kết quả và thảo luận

Một trong những thách thức chính của công nghệ nano Y sinh là tổng hợp các hạt nano. Bài viết này đã kiểm tra độc tính của SWCNTs As-Made (bao gồm các tập hợp có thể nhìn thấy được); tuy nhiên, thông tin này là đại diện cho hầu hết các hạt nano. Các SWCNT được tách thành nhóm As-Made và nhóm siêu ly tâm. Nhóm thứ nhất không trải qua bất kỳ quá trình tinh chế nào để loại bỏ tổng hợp trong khi nhóm thứ hai trải qua quá trình siêu ly tâm trong máy siêu ly tâm Beckman Coulter Optima MAX-XP.

Mặc dù ly tâm có hiệu quả trong việc loại bỏ các hạt nano tổng hợp, quy trình nghiên cứu phần nào bị cản trở bởi thời gian ly tâm dài, ít nhất là 6 giờ ở tốc độ thấp (5.000 xg đến 22.000 xg). Kỹ thuật siêu ly tâm mới này cho thấy rằng siêu ly tâm tốc độ cao, kéo dài hai phút có thể đạt được khả năng tương thích sinh học và các SWCNTs hòa tan riêng lẻ như thời gian ly tâm lâu hơn có thể, giúp các nhà nghiên cứu tiết kiệm thời gian gấp 180 lần.

Dữ liệu tán xạ ánh sáng động và hình ảnh quang học được chụp bằng DelsaMax PRO cung cấp bằng chứng rằng tất cả SWCNT tổng hợp đã được loại bỏ bằng siêu ly tâm nhanh. Có thể thu thập dữ liệu độc tính trong nghiên cứu này vì Vi-CELL XR đã được sử dụng; cốt liệu có khả năng hấp thụ mạnh có thể gây nhầm lẫn cho các xét nghiệm độc tính MMP và MTT điển hình.

Vi-CELL XR được lập trình để tìm kiếm cụ thể các tế bào hình cầu có đường viền xác định trong một phạm vi kích thước được thể hiện rõ ràng, nhằm giảm thiểu việc đếm các tập hợp ống nano carbon là chết hoặc còn sống. Do số lượng lớn các tập hợp xuất hiện ngay cả sau khi rửa tế bào, việc tối ưu hóa Vi-CELL XR là rất quan trọng.

Các ống nano siêu ly tâm được chạy mà không có bất kỳ tế bào nào, như một biện pháp kiểm soát, và trong thử nghiệm này, Vi-CELL XR không tính một tế bào nào là chết hay sống.

Dữ liệu phân phối kích thước. Các ống nano carbon đơn vách, sau khi siêu âm trong chất hoạt động bề mặt, vẫn có một số loài tổng hợp. Phân bố kích thước, được xác định bởi Dynamic Light Scattering trên DelsaMax PRO, cho thấy hai loài rộng (đường màu đỏ). Phạm vi kích thước đầu tiên, đường kính khoảng 100 nm, đại diện cho các ống nano carbon hòa tan riêng lẻ. Loại thứ hai, chứa hầu hết các ống nano carbon tổng hợp, có đường kính cực đại có kích thước gần bằng một micron. Sau quá trình siêu ly tâm kéo dài hai phút, SWNT chỉ chứng minh một loài rộng duy nhất ở 100nm, cho thấy rằng hầu như tất cả các tập hợp đã được loại bỏ. Điều này được thể hiện thêm bằng việc giảm 59% độ phân tán. Thật thú vị, điện thế zeta không thay đổi giữa các ống nano carbon tổng hợp và ly tâm. Điều này rất có thể là do lực đẩy không gian,
Hình 4: Dữ liệu phân phối kích thước.
Sơ đồ
Hình 5: Sơ đồ

Kết luận

So với SWCNT siêu ly tâm, SWCNT tổng hợp cho thấy độc tính cao hơn, điều này có thể là do độ che phủ của chất hoạt động bề mặt kém và kích thước lớn hơn của SWCNT tổng hợp. Bề mặt không chứa chất hoạt động bề mặt tiếp xúc nhiều hơn trong SWCNT tổng hợp và sự sẵn có bề mặt tăng lên của SWCNT góp phần trực tiếp vào việc tăng các loại oxy phản ứng (ROS). Ngoài ra, về tổng thể, SWCNT As-Made hoặc tổng hợp lớn hơn nhiều, như thể hiện qua dữ liệu tán xạ ánh sáng động. Kích thước lớn hơn của SWCNT có thể chặn các đường truyền tín hiệu tế bào hoặc cản trở hoạt động của tế bào và do đó ức chế sự phát triển của tế bào. Do đó, điều cần thiết là việc loại bỏ các hạt nano tổng hợp được thực hiện trước khi sử dụng in vitro hoặc in vivo.

Nguồn: https://www.news-medical.net/whitepaper/20150519/Particle-Characterization-and-Centrifugation-Tools-from-Beckman-Coulter-for-Nanomedicine-Applications.aspx

Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các sản phẩm hãng Beckman Coulter.