Cố định mô và Chất cố định – Quy trình thực hành để tối ưu hóa chất lượng, ảnh hưởng của nhiệt và vi sóng

cố định vi sóng

Quy trình thực hành cố định mô để tối ưu hóa chất lượng

Bằng cách tuân theo các nguyên tắc đơn giản, thông thường, bạn có thể đạt được kết quả cố định chất lượng cao và nhất quán. Dưới đây là ba yếu tố cần thiết:

Yếu tố 1: Mẫu mô tươi

1. Cố định càng sớm càng tốt. Lưu ý rằng quá trình thoái hóa bắt đầu ngay khi các tế bào bị thiếu nguồn cung cấp máu.

2. Nếu không thể cố định ngay lập tức, hãy làm lạnh, không đông lạnh.

3. Mô tươi có thể bị nhiễm trùng.

4. Không để mẫu vật bị khô. Việc làm khô bề mặt sẽ gây ra bất kỳ tổn thương trên mẫu vật, đặc biệt đối với các mẫu nội soi nhỏ

5. Không làm biến dạng mô. Sự biến dạng hoặc hư hỏng cơ học khác sẽ gây ra những thay đổi hình thái vĩnh viễn có thể ảnh hưởng đến kết quả

6. Ghi nhãn đầy đủ và chính xác. Điều cần thiết cho tài liệu chẩn đoán và nghiên cứu.

Yếu tố 2: Cố định mô với chất cố định đúng cách

7. Chất cố định ngấm đều vào mô. Luôn đặt mẫu vào vật chứa đã chứa sẵn chất cố định. Điều này sẽ ngăn cản sự bám dính của mẫu vào vật chứa.

8. Các cơ quan nên được mở. Nếu có thể, nên mở các cơ quan rỗng để có thể tiếp xúc ngay chất cố định.

9. Truyền dịch của một số mẫu vật. Cố định bằng tưới máu hệ thống mạch máu của toàn bộ cơ quan hoặc động vật thí nghiệm nhỏ có thể mang lại kết quả tốt

10. Độ dày rất quan trọng (tối đa 4mm). Độ dày của bất kỳ mẫu vật hoặc lát mô nào không được vượt quá 4 mm nếu muốn đạt được sự cố định tối ưu.

11. Xoay mẫu vật trong vài phút đầu tiên trong quá trình cố định sẽ hỗ trợ sự thẩm thấu.

12. Khối lượng vừa đủ (ít nhất là 20:1). Cần phải có quá nhiều chất cố định vì các thành phần hiệu quả của nó có thể bị cạn kiệt do một phần của phản ứng cố định.

13. Đủ thời gian. Chất cố định phải thâm nhập vào trung tâm của phần đậm đặc nhất của mẫu vật và sau đó các phản ứng hóa học của quá trình cố định phải diễn ra.

14. Nhiệt độ phòng là tốt nhất. Việc cố định ban đầu được thực hiện tốt nhất ở nhiệt độ phòng (20°C).

Yếu tố 3: Lựa chọn đúng chất cố định có công thức chính xác

15. Chất cố định phải được pha chế cẩn thận từ thuốc thử có chất lượng phù hợp, còn mới nếu được chỉ định. Thuốc thử chất lượng kém có thể tạo ra sự cố định chất lượng kém. Một số chất cố định được pha chế phải được tạo thành từ dung dịch gốc ngay trước khi sử dụng vì chúng không ổn định (ví dụ: dung dịch Helly).

16. Mẫu vật nhận được trong chất cố định phải được kiểm tra và thay thế chất cố định nếu cần thiết. Nếu mẫu được nhận là chất cố định có chất lượng không rõ ràng, hãy thay thế bằng chất cố định mới – nó chỉ có thể cải thiện kết quả.

17. Chất cố định chỉ nên được sử dụng một lần. Mẫu vật đổ tế bào và các mảnh mô vào dung dịch cố định có thể làm nhiễm bẩn bất kỳ mẫu vật nào tiếp theo. Ngoài ra, các thành phần được sử dụng hết trong các phản ứng cố định.

18. Tránh nắp kim loại. Một số chất cố định có tính ăn mòn cao và sẽ ăn mòn kim loại (ví dụ muối thủy ngân).

19. Nên áp dụng phương pháp điều trị phù hợp sau khi cố định. Một số chất cố định yêu cầu mẫu vật phải được rửa trong nước trước khi xử lý (ví dụ: Zenker hoặc Helly) hoặc có thể có một số yêu cầu khác (photphat có thể kết tủa từ dung dịch đệm ở nồng độ cồn lớn hơn 70%).

20. Tất cả các chất cố định đều độc hại và gây kích ứng. Để có thể khắc phục được chất cố định, nó phải độc hại và có khả năng gây kích ứng mặc dù chúng có mức độ khác nhau. Bất cứ ai sử dụng chất cố định nên nhận thức được những mối nguy hiểm tiềm ẩn.

csm_Scaled_Fig_1
Hình 1: Mẫu tim được cắt lát cẩn thận để chất cố định có thể thẩm thấu đều
csm_Scaled_Fig_2
Hình 2: Một mẫu mô mỡ ở vú đã được ép vào một hộp nhỏ chứa một lượng chất cố định không đủ. Trong trường hợp này rất có thể mẫu sẽ được cố định kém và bị biến dạng cơ học.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Bước đầu cho kỹ thuật xử lý và cố định sau đó

Bảng sau đây sẽ trình bày bước đầu cho quá trình xử lý paraffin cho từng chất cố định

Chất cố định

Cố định lại sau đó

Bắt đầu xử lý trong

Comment

Formol đệm photphat

Không có

Cố định bổ sung trong đệm formalin nếu cần, nếu không thì dùng ethanol 70%

Đặt mẫu ở nồng độ cồn lớn hơn 70% có thể gây kết tủa photphat từ dung dịch đệm.

canxi formol

không có

70% etanol

Dung dịch muối formal

Không có

Cố định bổ sung trong dung dịch muối chính thức nếu cần, nếu không thì dùng ethanol 70%

Kẽm formalin (không có đệm)

Rửa sạch nhanh trong nước

Cố định thêm bằng formalin nếu cần, nếu không thì dùng ethanol 70%.

Rửa sạch loại bỏ muối kẽm dư thừa có thể ăn mòn. Nếu sử dụng formalin đệm photphat ở trạm 1, muối kẽm dư có thể tạo thành kết tủa.

chất cố định Zenker

Rửa kỹ trong nước

70% etanol

Rửa sạch loại bỏ cromat, chất có thể tạo thành kết tủa không hòa tan. Các phần phải được xử lý để loại bỏ sắc tố thủy ngân trước khi nhuộm.

Chất cố định Helly

Rửa kỹ trong nước

70% etanol

Rửa sạch loại bỏ cromat, chất có thể tạo thành kết tủa không hòa tan. Các phần phải được xử lý để loại bỏ sắc tố thủy ngân trước khi nhuộm.

Chất cố định B-5

Sau khi cố định, bảo quản trong ethanol 70%

70% etanol

Các phần phải được xử lý để loại bỏ sắc tố thủy ngân trước khi nhuộm.

Giải pháp Bouin

Sau khi cố định, bảo quản trong ethanol 70%

70% etanol

Rửa nước sau khi cố định Bouin có thể loại bỏ một số picrate hòa tan. Đây là những chất không hòa tan sau khi xử lý bằng cồn

Hollande

Rửa nhanh trong nước

Cố định thêm bằng formalin đệm nếu cần, nếu không thì dùng ethanol 70%.

Cần rửa nước. Nếu sử dụng formalin đệm photphat ở trạm 1, muối dư có thể tạo thành kết tủa photphat không hòa tan.

Giải pháp Gendre

Rửa bằng cồn 80% để loại bỏ axit picric dư

cồn 80%

Axit picric dư có thể ảnh hưởng xấu đến sự nhuộm màu.

Giải pháp Clarke

Không có

80% etanol

Giải pháp Carnoy

Không có

etanol tuyệt đối

Việc cố định không nên kéo dài vì sẽ làm cứng quá mức.

methacarn

Không có

etanol tuyệt đối

Việc cố định không nên kéo dài vì sẽ làm cứng quá mức.

Cồn formalin

Không có

etanol tuyệt đối

Cồn axetic formol

Không có

etanol tuyệt đối

Ảnh hưởng của nhiệt trong quá trình cố định mô

Khi nhiệt độ của chất cố định tăng hoặc giảm, tốc độ khuếch tán vào mẫu vật bị ảnh hưởng, cũng như tốc độ của các phản ứng cố định hóa học xảy ra với các thành phần mô khác nhau. Nhiệt độ tăng làm tăng tốc quá trình cố định. Nhiệt độ quá cao, đặc biệt nếu kéo dài, có thể làm hỏng tế bào và làm mẫu bị co rút và cứng lại đáng kể.

Trong những ngày trước khi máy cắt lạnh được sử dụng rộng rãi, thông lệ tiêu chuẩn là cố định nhanh các mẫu nhỏ trong formalin sôi trước khi chuẩn bị các phần lạnh bằng máy cắt lạnh. Quá trình này tạo ra các mẫu vật có thể được cắt lát, nhưng cho kết quả hiển vi không quan trọng và rất khác nhau, ngoài việc thường xuyên khiến nhà vi mô phải tiếp xúc với nồng độ hơi formaldehyde không thể chấp nhận được.

Ngày nay, hầu hết các phòng thí nghiệm đều tiến hành cố định mẫu sơ cấp ở nhiệt độ môi trường và chỉ sau khi mẫu được đưa vào bộ xử lý, nhiệt độ cố định mới được tăng lên. Nhiệt độ thường được sử dụng trong khoảng từ 37°C đến 45°C.

Một vấn đề khác của việc sử dụng dung dịch cố định nóng để cố định ban đầu các mẫu lớn hơn (dày lớn hơn 3 mm) là mặt ngoài của mẫu cố định nhanh trong khi có thể mất khá nhiều thời gian để chất cố định thấm vào tâm khối và khu vực này có thể được cố định kém hoặc không được cố định chút nào. Sau đó, các khối thể hiện hiệu ứng cố định “khu vực” phóng đại với các đặc điểm hình thái và nhuộm màu khác nhau ở bên ngoài so với bên trong mẫu vật. Chính vì những lý do này mà việc cố định vi sóng được sử dụng trong một số phòng thí nghiệm.

Cố định lò vi sóng

Gia nhiệt bằng vi sóng như một phương pháp cố định mô được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1970. Từ thời điểm này, việc sử dụng lò vi sóng trong nghiên cứu mô bệnh học cho mục đích này và các mục đích khác như thu hồi kháng nguyên và nhuộm nhanh các phần đã ngày càng tăng.

Nhìn chung, có hai cách sử dụng công nghệ vi sóng để cố định mô. Mô tươi, được đặt trong nước muối hoặc dung dịch đẳng trương khác, có thể được chiếu xạ để tạo ra sự cố định ban đầu. Không sử dụng chất cố định hóa học ở giai đoạn này. Ngoài ra, các mẫu thử có thể được đặt trong chất đệm formalin hoặc một số chất cố định khác và ở giai đoạn sau, được cho vào lò vi sóng để hỗ trợ hoạt động cố định của chất cố định. Trong trường hợp sau này, việc quay vi sóng có thể được thực hiện trong khi mô đang ở trạng thái cố định, trong trường hợp đó có thể có một số nguy hiểm do khói độc sinh ra hoặc mô được chuyển trở lại nước muối hoặc dung dịch đệm cho bước vi sóng. Dù bằng cách nào, dung dịch cố định phải có mặt trong mô để quá trình cố định được hỗ trợ bằng vi sóng xảy ra. Việc cố định có sự hỗ trợ của vi sóng được sử dụng phổ biến hơn nhiều so với việc cố định bằng vi sóng cơ bản. Các chất cố định độc quyền có chứa glyoxal có độc tính tương đối thấp đã được phát triển để sử dụng trong quá trình cố định có hỗ trợ vi sóng.

Vi sóng là một dạng bức xạ không ion hóa được tạo ra bởi máy phát cao tần trong các lò vi sóng gia dụng và khoa học. Ở tần số 2,5 GHz, chúng có khả năng tạo ra nhiệt tức thời khi các phân tử lưỡng cực như nước hoặc chuỗi bên cực của protein tiếp xúc với từ trường xen kẽ của chúng với tốc độ 2,5 tỷ chu kỳ mỗi giây. Tốc độ mà năng lượng vi sóng sẽ tạo ra nhiệt trong quá trình cố định mô phụ thuộc vào một số yếu tố bao gồm cài đặt công suất và công suất đầu ra của lò, thể tích và tính chất của dung dịch giữ, thành phần, hình dạng và số lượng vật chứa (bao gồm cả cassette), sự khuấy trộn hoặc chuyển động của vật chứa và số lượng, thể tích và kích thước của mẫu thử được cố định. Theo Kok và Boon, vi sóng 2,5 GHz ít ảnh hưởng đến mô có độ sâu vượt quá 4 cm và đối với các lát mô cố định bằng vi sóng cơ bản không được có độ dày vượt quá 3 cm. Sau khi cho vào lò vi sóng, chúng phải được cắt ngay thành 2 mm và cho vào etanol 70%.. Để cố định bằng vi sóng, Leong gợi ý nên chuẩn bị các lát dày 2 mm từ các mô được cố định ban đầu bằng formalin trước khi xử lý bằng vi sóng. Do có nhiều biến số liên quan đến việc cố định vi sóng, điều quan trọng là mọi khía cạnh của kỹ thuật phải được chuẩn hóa đầy đủ (bao gồm cả kích thước mẫu vật nhất quán), lò vi sóng được hiệu chuẩn phù hợp và nhân viên thực hiện bước cố định phải hiểu đầy đủ các yếu tố ảnh hưởng kết quả cố định bằng vi sóng.

Nhiệt được coi là yếu tố chính gây ra tác động của vi sóng trong quá trình cố định mô. Ngoài việc tăng tốc độ khuếch tán, nhiệt sẽ làm tăng động học phân tử và tăng tốc độ phản ứng hóa học. Đã có cuộc thảo luận về những tác động khác mà vi sóng có thể gây ra, bao gồm sự phân hủy các oligome trong chất cố định aldehyd thành dimer và monome, những thay đổi do trường gây ra trong liên kết hydro cao phân tử, sự tạo đường hầm proton và sự phá vỡ nước liên kết.

Nguồn: https://www.leicabiosystems.com/knowledge-pathway/fixation-and-fixatives-5-practical-procedures-to-optimise-quality-the-effects-of-heat-and-microwaves/ 

Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các thiết bị Giải phẫu bệnh từ hãng Leica Biosystems.