Cố định mô và Chất cố định – Quy trình thực hành để tối ưu hóa chất lượng, ảnh hưởng của nhiệt và vi sóng

Khi nhiệt độ của chất cố định tăng hoặc giảm, tốc độ khuếch tán vào mẫu vật bị ảnh hưởng, cũng như tốc độ của các phản ứng cố định hóa học xảy ra với các thành phần mô khác nhau. Nhiệt độ tăng làm tăng tốc quá trình cố định. Nhiệt độ quá cao, đặc biệt nếu kéo dài, có thể làm hỏng tế bào và làm mẫu bị co rút và cứng lại đáng kể.

Trong những ngày trước khi máy cắt lạnh được sử dụng rộng rãi, thông lệ tiêu chuẩn là cố định nhanh các mẫu nhỏ trong formalin sôi trước khi chuẩn bị các phần lạnh bằng máy cắt lạnh. Quá trình này tạo ra các mẫu vật có thể được cắt lát, nhưng cho kết quả hiển vi không quan trọng và rất khác nhau, ngoài việc thường xuyên khiến nhà vi mô phải tiếp xúc với nồng độ hơi formaldehyde không thể chấp nhận được.

Ngày nay, hầu hết các phòng thí nghiệm đều tiến hành cố định mẫu sơ cấp ở nhiệt độ môi trường và chỉ sau khi mẫu được đưa vào bộ xử lý, nhiệt độ cố định mới được tăng lên. Nhiệt độ thường được sử dụng trong khoảng từ 37°C đến 45°C.

Một vấn đề khác của việc sử dụng dung dịch cố định nóng để cố định ban đầu các mẫu lớn hơn (dày lớn hơn 3 mm) là mặt ngoài của mẫu cố định nhanh trong khi có thể mất khá nhiều thời gian để chất cố định thấm vào tâm khối và khu vực này có thể được cố định kém hoặc không được cố định chút nào. Sau đó, các khối thể hiện hiệu ứng cố định “khu vực” phóng đại với các đặc điểm hình thái và nhuộm màu khác nhau ở bên ngoài so với bên trong mẫu vật. Chính vì những lý do này mà việc cố định vi sóng được sử dụng trong một số phòng thí nghiệm.

Gia nhiệt bằng vi sóng như một phương pháp cố định mô được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1970. Từ thời điểm này, việc sử dụng lò vi sóng trong nghiên cứu mô bệnh học cho mục đích này và các mục đích khác như thu hồi kháng nguyên và nhuộm nhanh các phần đã ngày càng tăng.

Nhìn chung, có hai cách sử dụng công nghệ vi sóng để cố định mô. Mô tươi, được đặt trong nước muối hoặc dung dịch đẳng trương khác, có thể được chiếu xạ để tạo ra sự cố định ban đầu. Không sử dụng chất cố định hóa học ở giai đoạn này. Ngoài ra, các mẫu thử có thể được đặt trong chất đệm formalin hoặc một số chất cố định khác và ở giai đoạn sau, được cho vào lò vi sóng để hỗ trợ hoạt động cố định của chất cố định. Trong trường hợp sau này, việc quay vi sóng có thể được thực hiện trong khi mô đang ở trạng thái cố định, trong trường hợp đó có thể có một số nguy hiểm do khói độc sinh ra hoặc mô được chuyển trở lại nước muối hoặc dung dịch đệm cho bước vi sóng. Dù bằng cách nào, dung dịch cố định phải có mặt trong mô để quá trình cố định được hỗ trợ bằng vi sóng xảy ra. Việc cố định có sự hỗ trợ của vi sóng được sử dụng phổ biến hơn nhiều so với việc cố định bằng vi sóng cơ bản. Các chất cố định độc quyền có chứa glyoxal có độc tính tương đối thấp đã được phát triển để sử dụng trong quá trình cố định có hỗ trợ vi sóng.

Vi sóng là một dạng bức xạ không ion hóa được tạo ra bởi máy phát cao tần trong các lò vi sóng gia dụng và khoa học. Ở tần số 2,5 GHz, chúng có khả năng tạo ra nhiệt tức thời khi các phân tử lưỡng cực như nước hoặc chuỗi bên cực của protein tiếp xúc với từ trường xen kẽ của chúng với tốc độ 2,5 tỷ chu kỳ mỗi giây. Tốc độ mà năng lượng vi sóng sẽ tạo ra nhiệt trong quá trình cố định mô phụ thuộc vào một số yếu tố bao gồm cài đặt công suất và công suất đầu ra của lò, thể tích và tính chất của dung dịch giữ, thành phần, hình dạng và số lượng vật chứa (bao gồm cả cassette), sự khuấy trộn hoặc chuyển động của vật chứa và số lượng, thể tích và kích thước của mẫu thử được cố định. Theo Kok và Boon, vi sóng 2,5 GHz ít ảnh hưởng đến mô có độ sâu vượt quá 4 cm và đối với các lát mô cố định bằng vi sóng cơ bản không được có độ dày vượt quá 3 cm. Sau khi cho vào lò vi sóng, chúng phải được cắt ngay thành 2 mm và cho vào etanol 70%.. Để cố định bằng vi sóng, Leong gợi ý nên chuẩn bị các lát dày 2 mm từ các mô được cố định ban đầu bằng formalin trước khi xử lý bằng vi sóng. Do có nhiều biến số liên quan đến việc cố định vi sóng, điều quan trọng là mọi khía cạnh của kỹ thuật phải được chuẩn hóa đầy đủ (bao gồm cả kích thước mẫu vật nhất quán), lò vi sóng được hiệu chuẩn phù hợp và nhân viên thực hiện bước cố định phải hiểu đầy đủ các yếu tố ảnh hưởng kết quả cố định bằng vi sóng.

Nhiệt được coi là yếu tố chính gây ra tác động của vi sóng trong quá trình cố định mô. Ngoài việc tăng tốc độ khuếch tán, nhiệt sẽ làm tăng động học phân tử và tăng tốc độ phản ứng hóa học. Đã có cuộc thảo luận về những tác động khác mà vi sóng có thể gây ra, bao gồm sự phân hủy các oligome trong chất cố định aldehyd thành dimer và monome, những thay đổi do trường gây ra trong liên kết hydro cao phân tử, sự tạo đường hầm proton và sự phá vỡ nước liên kết.

Nguồn: https://www.leicabiosystems.com/knowledge-pathway/fixation-and-fixatives-5-practical-procedures-to-optimise-quality-the-effects-of-heat-and-microwaves/