Chuẩn hóa nuôi cấy tế bào cho các thí nghiệm với kính hiển vi ZEISS Axiovert 5 Digital

Nuôi cấy tế bào có lẽ là thành phần quan trọng nhất của phòng thí nghiệm sinh học tế bào. Kỹ thuật này bao gồm nuôi cấy và tái tạo tế bào nhân chuẩn để tiếp tục sử dụng trong các thí nghiệm. Hoặc, trong trường hợp Giải pháp kính hiển vi nghiên cứu ZEISS, chuẩn bị các mẫu kính hiển vi để sử dụng cho việc phát triển các kỹ thuật kính hiển vi mới dành riêng cho ngành khoa học đời sống và y sinh. Các kỹ thuật viên ZEISS giàu kinh nghiệm được làm việc trong các phòng thí nghiệm y sinh được trang bị đầy đủ có thể giải quyết mọi vấn đề, câu hỏi, khía cạnh hàng ngày liên quan đến nuôi cấy tế bào. Mỗi loại tế bào phải được chăm sóc theo nhu cầu riêng và tất cả các tế bào phải được kiểm tra hàng ngày. Điều này bao gồm việc đo mật độ tế bào, xác định số lượng tế bào chính xác nhất có thể và xử lý các tế bào để chuẩn bị mẫu. Với giải pháp kính hiển vi nghiên cứu ZEISS, công việc này sẽ được thực hiện bằng Axiovert 5 Digital – Kính hiển vi soi ngược kết nối AI

 

 

Nuôi cấy tế bào và dòng tế bào

Để đưa tế bào vào nuôi cấy, bạn có thể nuôi cấy tế bào từ nguồn ban đầu hoặc đưa một lượng nhỏ tế bào cụ thể từ nguồn bên ngoài.

Các dòng tế bào điển hình được sử dụng trong phòng thí nghiệm kính hiển vi ZEISS là các tế bào biểu mô hoặc ung thư bất tử như HeLa, HEK, COS-7, U2OS và LLC-PK1.

Mỗi dòng tế bào có những đặc tính đặc trưng như kích thước, hình dáng bên ngoài hoặc độ bám dính. Tốc độ lan truyền cũng khác nhau ở tất cả d Nuôi cấy tế bào và dòng tế bào những nền văn hóa riêng lẻ.

Thực hiện

Chuẩn bị nuôi cấy tế bào LLC-PK1 cho nghiên cứu ứng dụng

Chuẩn bị nuôi cấy từ tế bào đông lạnh

Các tế bào LLC-PK1 được rã đông trong bể nước ở nhiệt độ 37°C và được chuyển vào ống nghiệm vô trùng chứa môi trường nuôi cấy tế bào. Các tế bào sau đó được ly tâm trong khoảng 5 phút với 900 vòng / phút.

LLC-PK1 dùng để chỉ tế bào biểu mô thận lợn. Dòng tế bào này có nguồn gốc từ thận của một con lợn đực khỏe mạnh bình thường (Sus scrofa), tuổi từ 3 – 4 tuần đã được Eli Lilly & Co. gửi vào và có hình thái biểu mô điển hình.

Chất nổi phía trên trước tiên cần phải được loại bỏ/hút. Sau đó, viên hoặc các phần của nó có thể được treo lại và chuyển vào bình nuôi cấy T75 với khoảng 10ml môi trường nuôi cấy. Bình nuôi cấy lúc này được đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 37°C, 5% CO2  và độ ẩm không khí tương đối là 97%. Môi trường nuôi cấy sau đó sẽ được thay thế bằng môi trường mới sau 24 giờ ủ.

 

Kiểm tra nguồn ô nhiễm

Sự phát triển và hình thái tế bào được theo dõi hàng ngày bằng kính hiển vi tương phản pha. Các loại ô nhiễm khác nhau có thể xảy ra khi làm việc với nuôi cấy tế bào – phổ biến nhất là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Một loại ô nhiễm vi khuẩn đặc biệt bất lợi có thể do mycoplasma gây ra. So với các vi khuẩn khác, những sinh vật nhân sơ rất nhỏ này thiếu thành tế bào và khó phát hiện.

Những bất thường về hình thái và màu sắc (Hình 6) của môi trường nuôi cấy có thể là dấu hiệu đầu tiên của việc nuôi cấy tế bào không khỏe mạnh.

 

 

 

Nếu không phát hiện thấy các đặc điểm hình thái hoặc ô nhiễm, các tế bào sẽ được nuôi cấy thêm trong các bình nuôi cấy tế bào cho đến khi chúng đạt được mật độ (độ hợp lưu) đặc trưng cho các dòng tế bào của chúng cần để phân tách. Tùy thuộc vào dòng tế bào và môi trường được sử dụng, tốc độ tăng trưởng có thể khác nhau.

Đối với hầu hết các dòng tế bào thường được sử dụng, bạn sẽ cần đạt được độ hợp lưu từ 70 – 80 % trước khi các tế bào sẵn sàng được phân chia và chuyển đi cho các thí nghiệm tiếp theo. Điều này đặc biệt quan trọng vì bạn sẽ muốn tránh những công việc không cần thiết do việc tách các ô quá sớm. Việc phân chia các tế bào ở một điểm hợp lưu cụ thể là điều cần thiết cho kết quả của các thí nghiệm và khả năng tái tạo của chúng. Việc phân chia sớm hoặc muộn có thể làm giảm sự phát triển của môi trường nuôi cấy.

 

Sử dụng Kính hiển vi Axiovert 5 Digital để xác định độ hợp lưu và số lượng tế bào của tôi rất dễ dàng. Các thuật toán AI giúp hoạt động nhanh hơn và có khả năng tái tạo cao hơn. Các mô-đun phần mềm được thiết kế đặc biệt cho các tác vụ này rất dễ sử dụng mà không cần có kiến thức trước về AI. Họ cung cấp các tiêu chuẩn chất lượng cao hơn cho mọi phòng thí nghiệm nuôi cấy tế bào.

 

 

Ngoài thói quen nuôi cấy tế bào hàng ngày, độ hợp lưu của tế bào và số lượng tế bào cũng là những thông số quan trọng để xác định các điều kiện trong đĩa thí nghiệm, để đánh giá các xét nghiệm điểm cuối và để tối ưu hóa các quy trình chuyển đổi tế bào. Với các mô-đun AI trong Labscope, nhiệm vụ này trở nên đơn giản.

 

 

 

 

 

Phương pháp cấy truyền tiếp

Khi đã đạt được mức hợp lưu thích hợp trong bình nuôi cấy, các tế bào phải được chia vào các bình chứa tế bào khác nhau tùy theo số lượng tế bào cần thiết cho thí nghiệm đã lên kế hoạch (Hình 10). Mỗi dòng tế bào có số lượng tế bào cụ thể cần được cấy vào một thể tích môi trường nhất định. Đầu tiên, các tế bào bám dính phải được tách ra khỏi bề mặt đáy bình bằng cách sử dụng trypsin hoặc lực cơ học. Sau khi tách ra, chúng được đưa vào trạng thái lơ lửng với một thể tích môi trường xác định. Bằng cách đo một lượng nhỏ huyền phù, người ta có thể xác định nồng độ tế bào bằng kính hiển vi và độ tương phản pha. Thể tích huyền phù chính xác sau đó được phân phối vào các bình nuôi cấy tế bào khác nhau và các tế bào được phủ môi trường tăng trưởng mới lên trên và đặt vào tủ ấm để phát triển.

Theo truyền thống, công việc này được thực hiện thủ công với buồng đếm Neubauer cải tiến. Các ô trong 4 ô vuông góc (mỗi ô có kích thước 1 mm × 1 mm) có thể được đếm theo độ tương phản pha. Nồng độ (MV) hay tổng số tế bào trên mỗi ml được tính bằng: MV = [(Tổng số tế bào đếm được trong 4 ô vuông/4) × hệ số pha loãng × hằng số buồng] trên mỗi ml. Hằng số buồng điển hình là 104. Tùy thuộc vào độ chính xác mong muốn, đôi khi có ít hơn 4 ô vuông được tính.

Xác định sự sống của tế bào

Nếu bạn sắp mô tả các điều kiện môi trường cho một thí nghiệm không còn cần thiết phải tách các tế bào ra để lấy tế bào đếm.

Giờ đây, việc giao quy trình này cho Mô-đun đếm tế bào AI từ Phòng thí nghiệm ZEISS sẽ dễ dàng hơn và trên hết là thân thiện với tế bào hơn. Việc đếm tế bào tự động trong mỗi lô tế bào được thực hiện trong vài giây bằng kính hiển vi tương phản pha và không đưa tế bào ra khỏi giai đoạn phát triển của chúng. Do đó, bạn có thể đo số lượng ô trong một trường nhìn chỉ bằng một cú nhấp chuột. Lặp lại điều này ở nhiều vị trí trong mẫu của bạn sẽ dẫn đến tổng số tế bào trung bình và ngoại suy của bình nuôi cấy tế bào này.

 

Làm việc với mô-đun này cho phép đo số lượng tế bào có thể tái tạo và đo độ hợp lưu, trực tiếp trong bình nuôi cấy. Nó nhanh chóng và phù hợp với quy trình nuôi cấy tế bào tổng thể. Mô-đun này có thể cải thiện chất lượng nuôi cấy tế bào thông thường của bạn mà không cần thực hiện thêm công việc nào.

Việc đo nhanh số lượng tế bào và độ hợp lưu của tế bào cũng được khuyến nghị trước khi thực hiện các thí nghiệm. Phản ứng của tế bào có thể phụ thuộc mạnh mẽ vào sự tương tác giữa tế bào và tế bào. Do đó, số lượng tế bào và hợp lưu là các thông số quan trọng để mô tả trước các điều kiện thí nghiệm. Điều này cho phép bạn loại trừ các biến thể không mong muốn và thực hiện các thử nghiệm theo cách có thể lặp lại nhiều hơn.

Nguồn: https://pages.zeiss.com/rs/896-XMS-794/images/EN_wp_Axiovert-5-digital_prepare-cells-for-experiments.pdf?version=0&utm_source=zeiss&utm_campaign=C-00011934&utm_medium=newsletter