Giới thiệu
Sự chiếu sáng của mẫu vật là yếu tố quan trọng nhất để đạt được hình ảnh chất lượng cao trong kính hiển vi và kỹ thuật chụp ảnh hiển vi quan trọng hoặc hình ảnh kỹ thuật số. Chiếu sáng Kohler lần đầu tiên được giới thiệu vào năm 1893 bởi August Köhler của tập đoàn Carl Zeiss như một phương pháp cung cấp ánh sáng tối ưu cho mẫu vật. Các nhà sản xuất đã thiết kế kính hiển vi hiện đại sao cho thấu kính hội tụ và bất kỳ thành phần quang học nào khác được tích hợp vào chân đế của kính hiển vi sẽ chiếu được hình ảnh phóng to và hội tụ của dây tóc đèn lên mặt phẳng của màng chắn sáng của tụ quang được định vị đúng cách. Việc đóng hoặc mở màng chắn sáng của tụ quang điều khiển góc của các tia sáng đi ra khỏi tụ quang và chiếu tới mẫu vật từ tất cả các góc phương vị. Bởi vì nguồn sáng không hội tụ tại mẫu vật, nên ánh sáng ở đó về cơ bản là không hạt và mở rộng, đồng thời không bị giảm chất lượng do bụi và các lỗi trên bề mặt thủy tinh của thiết bị ngưng tụ. Việc mở và đóng màng chắn sáng của tụ quang phân áp điều khiển góc của hình nón ánh sáng chiếu tới mẫu vật. Cài đặt màng chắn sáng của tụ quang phân áp, cùng với khẩu độ của vật kính, sẽ xác định khẩu độ số của hệ thống kính hiển vi. Khi màng chắn tụ quang được mở ra, khẩu độ số của kính hiển vi tăng lên, dẫn đến khả năng phân giải và độ truyền ánh sáng lớn hơn. Các tia sáng song song đi qua và chiếu sáng mẫu vật được đưa đến hội tụ ở mặt phẳng tiêu điểm phía sau của vật kính, tại đó hình ảnh của màng chắn sáng của tụ quang biến đổi và hình ảnh của nguồn sáng sẽ được nhìn thấy rõ nét.
Cấu hình phù hợp của kính hiển vi liên quan đến chiếu sáng có thể là một trong những khái niệm bị hiểu sai nhiều nhất trong kính hiển vi quang học và là một thông số quan trọng phải được đáp ứng để đạt được hiệu suất tối ưu. Cường độ và phổ bước sóng của ánh sáng do nguồn chiếu sáng phát ra có tầm quan trọng lớn, nhưng điều quan trọng hơn nữa là ánh sáng phát ra từ các vị trí khác nhau trên dây tóc của đèn được thu thập và hội tụ tại mặt phẳng của màng chắn sáng của tụ quang. Trường liên hợp và các mặt phẳng khẩu độ quan trọng để thiết lập sự chiếu sáng thích hợp trong kính hiển vi được minh họa trong Hình 1. Trong phần này, các hướng dẫn được mô tả để thiết lập sự chiếu sáng Köhler (được sử dụng trong kính hiển vi huỳnh quang truyền ánh sáng phản xạ).
Các bước đầu tiên cần thiết để chuẩn bị cho chiếu sáng Köhler bao gồm các quy trình cơ bản cần thiết để quan sát mẫu vật trong điều kiện trường sáng. Đầu tiên, nếu tụ quang chứa các đĩa chặn hình khuyên, lăng kính tương phản giao thoa vi sai hoặc các bộ lọc khác, hãy xoay turret đến khẩu độ trường sáng, khẩu độ này sẽ mở và không chứa bộ lọc hoặc lăng kính. Thứ hai, chọn một mẫu vật phù hợp. Các mẫu vật tốt nhất bao gồm các mẫu trường sáng được nhuộm màu tốt, chẳng hạn như mô động vật hoặc thực vật rất mỏng (8 micromet trở xuống). Nếu không có sẵn một lam kính đã chuẩn bị sẵn, một phần nhỏ của màng film 35 milimét (chẳng hạn như film trong suốt hoặc âm bản) có kích thước khoảng 10 x 10 milimét có thể được dán vào tiêu bản kính hiển vi và làm phẳng bằng lam kính.
Các bước thiết lập Chiếu sáng Köhler
- Bật nguồn sáng và giữ một tờ giấy nhỏ ngay phía trên thấu kính hội tụ màng chắn sáng ở chân đế kính hiển vi (Hình 2(a)). Mục đích là kiểm tra xem nguồn sáng có hoạt động hay không và sẽ chiếu ánh sáng vào kính hiển vi. Trong trường hợp không quan sát thấy ánh sáng và giấy vẫn tối, hãy kiểm tra dây điện, đèn chiếu sáng và có thể cả cầu chì trong bộ nguồn để đảm bảo rằng các bộ phận điện còn nguyên vẹn. Nếu không, hãy thay đổi đèn chiếu sáng. Khi kính hiển vi hoạt động bình thường, một đốm sáng nhỏ (Hình 2(a)) sẽ hiện rõ trên giấy.
- Tiếp theo, mở màng chắn sáng đến vị trí rộng nhất (mở hoàn toàn) bằng cách xoay cần hoặc núm. Điểm sáng chiếu lên tờ giấy (Hình 2(b)) sẽ đạt được đường kính lớn nhất.
- Bước tiếp theo là di chuyển tờ giấy và đặt nó vào giữa mẫu vật và vật kính (Hình 3(a)) và mở hoàn toàn màng chắn sáng của tụ quang (thường được điều khiển bằng một cần gạt hoặc núm có khía nằm trên vỏ bộ ngưng tụ. Như màng chắn sáng của tụ quang mở ra từ từ, cường độ ánh sáng chiếu vào tờ giấy sẽ tăng lên, đạt được độ sáng tối đa ở cài đặt mở hoàn toàn. Khi sử dụng tụ quang khẩu độ số thấp được trang bị thấu kính xoay phía trước, hãy tháo thấu kính xoay khỏi đường đi của ánh sáng trước khi thực hiện quy trình này.
- Chiều cao của tụ quang có thể được điều chỉnh bằng cách sử dụng núm điều khiển dịch thành phần này lên và xuống dọc theo trục quang của kính hiển vi (Hình 3(b)). Đặt chiều cao của tụ quang sao cho thấu kính phía trước cách bề mặt dưới của mẫu lam khoảng 1 đến 3 mm. Đảm bảo rằng thấu kính phía trước của bộ ngưng tụ không tiếp xúc với lam kính (hoặc đẩy nó lên khỏi bàn soi mẫu). Trong những trường hợp đặc biệt, việc đẩy tụ quang vào mẫu thử sẽ dẫn đến việc mẫu bị đẩy ra khỏi bàn sa trượt. Các kính hiển vi hiện đại thường được trang bị một vít chặn có thể điều chỉnh cho phép cố định vị trí trên cùng của tụ quang ở độ cao xác định trước.
- Bây giờ ánh sáng có thể nhìn thấy được trong thị kính của kính hiển vi (Hình 4(a)). Nếu ánh sáng quá sáng, hãy giảm cường độ cho đến khi bạn tìm thấy mức độ phù hợp để làm việc. Tiếp theo, đặt khoảng cách giữa các vòng tròn thị kính bằng cách dịch chuyển ống quan sát. Khoảng cách chính xác đạt được khi có thể dễ dàng nhìn thấy một vòng tròn ánh sáng lớn qua thị kính. Bước tiếp theo là kiểm tra xem kính hiển vi có được trang bị thị kính hội tụ hay không. Nếu vậy, xoay thị kính di động về cài đặt ban đầu
- Nhìn vào kính hiển vi và di chuyển bàn soi mẫu, bao gồm cả mẫu vật, lên và xuống cho đến khi bạn nhìn thấy chi tiết hình ảnh sắc nét nhất có thể (Hình 4(b)). Tại thời điểm này, có thể có các điểm sáng và tối hoặc một phần của màng chắn khuất sáng vì cấu hình chiếu sáng vẫn chưa hoàn tất.
- Bây giờ, các thành phần cơ bản của kính hiển vi đã được thiết lập, thiết bị đã sẵn sàng được cấu hình để chiếu sáng Köhler. Bước đầu tiên là thu hẹp kích thước của màng chắn sáng và dịch tụ quang lên và xuống thông qua núm điều chỉnh cho đến khi bạn nhìn thấy hình ảnh sắc nét của các cạnh(Hình 5(a)). Nếu cách này không hiệu quả, hãy thay đổi kích thước của màng chắn sáng và thử lại.
- Ở giai đoạn này, màng chắn sáng được lấy nét rõ nét, nhưng tụ điện vẫn chưa được định tâm. Các núm định tâm trên khung lắp tụ quang của kính hiển vi được sử dụng để định tâm tụ quang (Hình 5(b)). Đóng màng chắn sáng đến độ mở nhỏ nhất của nó và sử dụng các vít định tâm để di chuyển lỗ sáng đến trung tâm của trường quan sát (một lưới hình chữ thập rất hữu ích để xác định tâm của trường quan sát). Khi tụ quang đã ở chính giữa, hãy mở màng chắn sáng cho đến khi các bộ phận của nó di chuyển hoàn toàn ra khỏi trường quan sát.
- Tại thời điểm này trong quy trình, bạn gần như đã có một hình ảnh phù hợp trong trường nhìn. Cuối cùng là tối ưu hóa độ tương phản. Hãy nhớ rằng trước tiên bạn mở màng khẩu độ của tụ quang để nhìn thấy nhiều ánh sáng hơn. Giờ đây, kích thước khẩu độ phải được điều chỉnh để cải thiện độ tương phản và tìm kiếm sự cân bằng phù hợp giữa độ tương phản và độ phân giải. Hãy nhớ rằng việc đóng khẩu độ tụ quá xa sẽ làm giảm độ phân giải nghiêm trọng và làm tối đáng kể hình ảnh.
- Bạn có thể hình dung trực tiếp màng chắn sáng được đặt chồng lên mặt phẳng tiêu cự phía sau của vật kính, nếu bạn tháo thị kính khỏi giá đỡ ống quan sát và nhìn thẳng vào ống (Hình 6(a)). Mắt của bạn nên cách ống từ 10 đến 20 cm để quan sát tốt nhất. Trong khi nhìn xuống ống, hãy mở và đóng màng chắn sáng của tụ quang cho đến khi bạn có thể nhận ra hình ảnh rõ ràng trong đồng tử vật kính. Cuối cùng, đặt đường kính của màng chắn sao cho nó chiếu sáng trong khoảng từ 65 đến 80 phần trăm đường kính vòng tròn thị kính (xem Hình 6(b)), mang lại độ phân giải gần như đầy đủ và độ tương phản tối ưu. Sau khi điều chỉnh màng chắn sáng, hãy lắp lại thị kính vào giá đỡ ống quan sát
Các kính hiển vi phải được cấu hình phù hợp để quan sát các mẫu vật trong điều kiện chiếu sáng của Köhler, nhưng chỉ dành cho vật kính được sử dụng để đặt thiết bị. Khi một vật kính khác được xoay vào hệ thống quang học, bạn phải luôn điều chỉnh khẩu độ của tụ quang và màng chắn sáng để có các điều kiện chiếu sáng (về hiệu ứng, độ tương phản so với độ phân giải) tối ưu. Tuy nhiên, thường không cần thiết phải tháo thị kính mỗi khi sử dụng vật kính mới. Khi kích thước màng chắn sáng đã được đặt cho vật kính 10x, thường đủ để điều chỉnh kích thước cho các vật kính khác bằng cách trực quan hóa hình ảnh. Đầu tiên hãy mở khẩu độ cho đến khi đạt đến điểm dừng, sau đó đóng nó lại từ từ cho đến khi hình ảnh bắt đầu tối hơn một chút và độ tương phản đồng thời tăng lên.
Từ cuộc thảo luận ở trên, rõ ràng là màng chắn sáng của tụ quang nên được đặt giữa ánh sáng trực tiếp và ánh sáng lệch, phụ thuộc phần lớn vào các đặc tính hấp thụ, nhiễu xạ và khúc xạ của mẫu vật. Điều này phải được thực hiện mà không làm cho hình ảnh bị hỗn loạn. Lượng chi tiết hình ảnh và độ tương phản cần thiết để tạo ra máy chụp ảnh quang vi tốt nhất cũng phụ thuộc vào chỉ số khúc xạ, đặc điểm quang học và các thông số phụ thuộc vào mẫu vật khác.
Khi màng chắn sáng bị đóng quá xa, ánh sáng bị lệch bắt đầu khuất các tia chiếu sáng trực tiếp, dẫn đến hiện tượng nhiễu xạ gây ra các vân, dải và/hoặc hình thành hoa văn có thể nhìn thấy trong máy chụp ảnh quang học. Các vấn đề khác, chẳng hạn như hiện tượng khúc xạ, cũng có thể tạo ra các cấu trúc rõ ràng trong ảnh không có thật. Ngoài ra, việc mở màng chắn sáng tụ quang quá rộng sẽ gây ra hiện tượng lóa và tán xạ ánh sáng không mong muốn từ mẫu vật và các bề mặt quang học bên trong kính hiển vi. Điều này dẫn đến mất độ tương phản đáng kể và làm mất chi tiết hình ảnh.
Hệ thống chiếu sáng của kính hiển vi, khi được điều chỉnh để chiếu sáng Köhler thích hợp, phải đáp ứng một số yêu cầu. Khu vực được chiếu sáng của mặt phẳng mẫu ít nhất phải lớn bằng trường quan sát đối với bất kỳ vật kính nào. Ngoài ra, ánh sáng phải có cường độ đồng đều và khẩu độ số phải thay đổi từ giá trị tối đa (bằng giá trị của vật kính) đến giá trị tối thiểu phụ thuộc vào đặc tính quang học của mẫu vật.
Nguồn: https://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/kohler.html
Công ty Minh Khang là nhà phân phối độc quyền thị trường miền Nam phân khúc kính hiển vi hãng Carl ZEISS.