Tài liệu này bao gồm các bước chính của quy trình chuẩn bị mẫu phân tích hạt đơn (SPA) trong cryo-EM và cung cấp danh sách đầy đủ các công cụ và thiết bị được khuyến nghị để đưa quy trình chuẩn bị mẫu cryo-EM vào phòng thí nghiệm.
Một mẫu SPA cryo-EM thường là một huyền phù trong trạng thái đông của vật liệu sinh học, bao gồm protein, phức hợp protein, virus hoặc các đại phân tử khác.
Vì chuẩn bị mẫu là một bước quan trọng trong quy trình phân tích hạt đơn, việc hiểu rõ các bước liên quan và có các thiết bị phù hợp là rất quan trọng. Để giúp bạn chuẩn bị các tấm lưới cryo-EM tốt nhất có thể, Thermo Fisher Scientific cung cấp:
- Trang web chuyên dụng về chuẩn bị mẫu
- Ứng dụng Scientific Workflows (cho iOS và Android), cung cấp hướng dẫn từng bước cho quy trình chuẩn bị mẫu cryo-EM
- Chăm sóc khách hàng cung cấp các khuyến nghị thực tiễn cho các phòng thí nghiệm chuẩn bị mẫu
- Danh sách đầy đủ các thiết bị cần thiết cho việc chuẩn bị mẫu cryo-EM (được cung cấp bên dưới)
- Tổng quan đầy đủ về các quy trình chuẩn bị mẫu đã được phát triển và công bố. Điều này cho phép chọn quy trình tốt nhất dựa trên loại mẫu đang làm việc
Các bước chuẩn bị mẫu
Để chuẩn bị một mẫu cryo-EM phù hợp cho việc thu thập dữ liệu độ phân giải cao, các bước sau đây thường được thực hiện:
Tinh sạch protein
Mặc dù quy trình phân tích hạt đơn có thể giải quyết một phần tính không đồng nhất trong mẫu thông qua các quy trình phân loại 3D, nhưng vẫn cần phải tinh sạch sinh hóa mẫu để có được dung dịch chứa các protein mục tiêu đã được cô lập.
Mẫu cryo-EM thường được chuẩn bị bằng cách sử dụng 2-5 μL dung dịch protein có nồng độ 50 nM – 5 μM, tùy thuộc vào mẫu, lưới EM, và các điều kiện sử dụng cho quá trình làm lạnh. Đối với các nghiên cứu cấu trúc, mẫu phải duy trì hoạt tính và ổn định trong các điều kiện tối ưu, in vitro (tức là thành phần đệm). Một xét nghiệm sinh hóa hoặc chức năng phù hợp cũng có thể được sử dụng để kiểm tra tính ổn định và hoạt tính của protein.
Chất lượng của mẫu trước khi làm lạnh là yếu tố quan trọng cho sự thành công của việc chụp ảnh cryo-EM sau này. Mẫu protein lý tưởng cho cryo-EM cần đáp ứng các yêu cầu sau:
- Độ tinh sạch mẫu rất cao (>99%) (chỉ có một band trên SDSPAGE gel)
- Tính không đồng nhất về thành phần ở mức tối thiểu (chỉ có một đỉnh trên sắc ký SEC, hoặc một phân bố khối lượng duy nhất trong phép đo khối phổ ở trạng thái tự nhiên)
- Tính không đồng nhất về cấu dạng ở mức tối thiểu (tức là bị khóa ở một trạng thái hoặc chỉ có một vài trạng thái khác nhau)
- Chứa mức độ rất thấp (<2%) chất bảo quản cryo (ví dụ: glycerol) và có nồng độ ion thấp (<500 mM)
Các phương pháp sinh hóa/sinh lý phổ biến được sử dụng để đánh giá thành phần và tính đồng nhất của mẫu protein bao gồm:
- Điện di gel polyacrylamide (SDS-PAGE)
- Sắc ký lọc gel (SEC)
- Phép đo khối phổ ở trạng thái tự nhiên (nMS)
- Tán xạ ánh sáng động (DLS)
Thông thường, hầu hết các kỹ thuật này đều có sẵn trong các phòng thí nghiệm sinh hóa thông thường. Do đó, không cần đầu tư thêm hoặc chỉ cần rất ít cho phần chuẩn bị mẫu cryo-EM này.
Đánh giá chất lượng mẫu
Một phương pháp đơn giản và dễ dàng để đánh giá chất lượng của các mẫu sinh học tinh sạch ở cấp độ hiển vi là kính hiển vi điện tử nhuộm âm, giúp đánh giá định tính tính đồng nhất về thành phần và cấu dạng của mẫu. Thường thì việc đánh giá này được thực hiện trên kính hiển vi có cơ chế đưa mẫu từ phía bên cột quang học (ví dụ: Thermo Scientific™ Talos™ L120C hoặc F200C TEM) hoặc hệ thống tải bán tự động (ví dụ: Thermo Scientific Tundra™ Cryo-TEM) vì sàng lọc thường được thực hiện trên một tấm lưới tại một thời điểm, và thời gian thực tế sử dụng kính hiển vi là ngắn.
Bên cạnh đó, phép đo khối phổ ở trạng thái tự nhiên có thể đẩy nhanh quá trình sàng lọc mẫu cryo-EM và bổ sung cho quá trình chuẩn bị mẫu thành công trong quá trình đông thủy tinh.
Ngoài ra, việc sàng lọc chất lượng sinh hóa có thể được thực hiện trong điều kiện đông lạnh, kết hợp hiệu quả với sàng lọc mẫu hydrat đông lạnh, như được mô tả trong phần tiếp theo. Sàng lọc cryo có thể tận dụng Bộ Kit Sàng Lọc Đệm Thermo Scientific VitroEase™ để tìm ra các điều kiện tối ưu giúp tạo ra mẫu đông ổn định. Lưu ý rằng những điều kiện này có thể khác với điều kiện tối ưu đã tìm thấy bằng phương pháp dung dịch hoặc nhuộm âm, vì chúng tính đến những thách thức bổ sung thường gặp trong cryo-EM, chẳng hạn như định hướng ưu tiên của các hạt hoặc hiện tượng biến tính protein tại giao diện nước-không khí.
Bảo quản mẫu
Làm lạnh là yếu tố quan trọng trong cryo-EM vì nó giúp mẫu tương thích với môi trường chân không của kính hiển vi, giữ các hạt riêng lẻ tại chỗ và giảm thiệt hại do tia bức xạ gây ra. Để bảo quản cấu trúc đại phân tử, quá trình làm lạnh phải diễn ra đủ nhanh để tránh sự hình thành tinh thể băng. Điều này được thực hiện bằng cách nhanh chóng ngâm lưới vào etan lỏng; sau đó mẫu được giữ trong nitơ lỏng để bảo quản tính chất vô định hình của lớp băng và tránh hư hại cho các hạt sinh học. Mẫu hydrat lạnh kết quả có các phân tử mẫu riêng lẻ được ngâm và phân bố đều trong một lớp vô định hình (dạng thủy tinh).
Toàn bộ quy trình này có thể được đơn giản hóa bằng cách sử dụng các thiết bị ngâm mẫu bán tự động như Hệ thống Thermo Scientific Vitrobot™. Việc sử dụng một loạt các thông số chính (tức là thời gian thấm mẫu, lực thấm, độ ẩm tương đối, và nhiệt độ) cho phép chuẩn bị mẫu đông lạnh chất lượng cao một cách nhất quán. Kính hiển vi cryo-electron của Thermo Scientific cũng sử dụng các giá đỡ mẫu AutoGrid đã được cấp bằng sáng chế, là tiêu chuẩn trong ngành về khả năng tải và dỡ mẫu cryo một cách ổn định và đáng tin cậy bằng bộ tải mẫu tự động. AutoGrid cũng cho phép hoán đổi mẫu giữa các kính hiển vi khác nhau trong quy trình, vì vậy việc chuẩn bị mẫu có thể được thực hiện trong một phòng thí nghiệm sinh hóa tiêu chuẩn.
Các thiết bị được liệt kê dưới đây được khuyến nghị cho việc thiết lập quy trình chuẩn bị mẫu cryo-EM tối ưu.
| Thiết bị được đề xuất để chuẩn bị mẫu cryo-EM | ||
| Thiết bị | Mục tiêu | Nhà cung cấp được đề xuất |
| Hệ thống Vitrobot Mark IV | Làm lạnh các lưới | Thermo Fisher Scientific |
| Thiết bị phóng điện Quorum Glocube/máy làm sạch plasma/máy bay hơi carbon | Chuẩn bị lưới
• Tính ưa nước của màng hỗ trợ lưới EM đạt được và được kiểm soát bằng phương pháp phóng điện phát sáng hoặc xử lý plasma để tối ưu hóa sự phân bố các hạt trong lớp băng • Cung cấp một lớp carbon bổ sung, tùy chọn |
Mitigen via Thermo Fisher Scientific |
| Nhíp mềm ESD (xả tĩnh điện) 15mm, Đầu cực mảnh (hoặc tương đương) | Thao tác chung của lưới trước khi làm lạnh | Agar Scientific |
| Worthington Industries LD4 4 lít LN2 Dewar | Đổ nitơ dễ dàng | Mitigen via Thermo Fisher Scientific |
| Bình chứa Taylor Wharton LN2 120l có đầu nối và ống dẫn lạnh | Linde Group | |
| Tủ chống nổ cho etan, bao gồm lắp đặt và kết nối với ống xả | Asecos via Fisher Scientific | |
| Bình gas ethane 20l | Airliquide | |
| Tủ lạnh nitơ lỏng công suất lớn Worthington Industries HC34 có đế lăn | Mitigen via Thermo Fisher Scientific | |
| Hệ thống Puck và Lưới lưu trữ Cryo-EM | Mitigen via Thermo Fisher Scientific | |
| Bình bọt: 800 mL | Mitigen via Thermo Fisher Scientific | |
| Worthington Industries CX100 Dryshipper và Shipping Case | Làm lạnh các lưới | Mitigen via Thermo Fisher Scientific |
| Bể chứa khô kỹ thuật số với máy gia nhiệt khối | Cryo-tools khô trong quá trình cắt lưới và tải | Thermo Fisher Scientific |
| Pipet 0,5-10 μL | Áp dụng mẫu trên lưới | Thermo Fisher Scientific |
| Tủ sấy | Làm khô nhanh và triệt để các dụng cụ nhỏ | MilliporeSigma |
| Tipper ni tơ lỏng | Đổ nitơ dễ dàng vào bình dewars | BOC |
| Phụ kiện do Thermo Fisher Scientific cung cấp, như một phần của dịch vụ cung cấp kính hiển vi điện tử lạnh
• Công cụ chèn kẹp chữ C (4x) • Công cụ căn chỉnh AutoGrid • Hộp đựng AutoGrid • Hộp đựng lưới • Hệ thống lắp ráp lưới tự động |
Các công cụ nhỏ để lắp ráp và lưu trữ AutoGrids | Thermo Fisher Scientific |
| Vật tư tiêu hao – một bộ khởi động sẽ được cung cấp bởi Thermo Fisher Scientific như một phần của việc cung cấp kính hiển vi điện tử lạnh
• Vòng kẹp chữ C (AutoGrids) • Kẹp chữ C • Lưới EM |
Nguồn etan cho lưới điện | Thermo Fisher Scientific |
| Bộ dụng cụ sàng lọc đệm Vitroease | Tối ưu hóa mẫu để chuẩn bị lưới cryo-EM tối ưu | Thermo Fisher Scientific |
| Thiết bị tùy chọn để chuẩn bị mẫu cryo-EM | ||
| Thiết bị | Mục tiêu | Nhà cung cấp được đề xuất |
| Phần mềm Thermo Scientific EPU Multigrid | Tăng thông lượng sàng lọc bằng cách tự động thu thập hình ảnh cho tối đa 12 lưới trên hệ thống Autoloader TEM | Thermo Fisher Scientific |
| Lắp ráp nhíp Cryo (Tương thích với Vitrobot) | Nhíp thay thế cho Hệ thống Vitrobot Mk 4 | NanoSoft via Thermo Fisher Scientific |
| Igloo (Tương thích với Vitrobot) | Cung cấp môi trường được kiểm soát tốt hơn cho việc chuyển mẫu và giảm thiểu ô nhiễm | NanoSoft via Thermo Fisher Scientific |
| Công cụ kiểm tra AutoGrid | Tạo điều kiện thuận lợi cho việc kiểm tra AutoGrids trước khi nạp vào cassette tải tự động | NanoSoft via Thermo Fisher Scientific |
| Bình ngưng tụ Ethane (tương thích với Vitrobot) | Tăng hiệu quả ngưng tụ etan | NanoSoft via Thermo Fisher Scientific |
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các dòng Kính hiển vi điện tử truyền qua(TEM) hãng Thermo Fisher Scientific.
EN