Đối với chẩn đoán thông thường, phương pháp nhuộm Hematoxylin và Eosin (H&E) cho đến nay vẫn được sử dụng phổ biến bởi các nhà nghiên cứu bệnh học để xem chi tiết cấu trúc tế bào và mô. Sự thay đổi độ nhuộm thường theo sở thích hoặc kinh nghiệm của nhà nghiên cứu bệnh học.
![H-and-E-Staining-Tổng quan-A-Hướng dẫn-thực hành tốt nhất-img01](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-01/H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practices-img01.jpg?itok=SNEZgvxn)
Quy trình nhuộm cho H&E tuân theo một giao thức cơ bản:
- Khử parafin
- Khử nước
- Hematoxylin
- Sự phân hoá
- Làm mờ
- Eosin
- Làm sạch
- Dán lam
Định dạng được sao chép dễ dàng và thuốc thử đủ để nhuộm một số lượng lớn tiêu bản một cách nhất quán trước khi cần thay đổi thuốc thử.
![H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practices-img02](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-01/H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practices-img02.jpg?itok=CRK6w4n5)
Trước đây, thuốc nhuộm và các thành phần thường được thực hiện bởi phòng thí nghiệm. Thuốc thử làm sẵn trên thị trường không phổ biến và đắt tiền. Vì vậy, để thực hiện nhuộm H&E tiết kiệm, các kỹ thuật viên đã học cách tạo ra thuốc nhuộm khi cần thiết. Thách thức là đảm bảo chất lượng của thuốc nhuộm một cách nhất quán. Các công nghệ khác nhau làm theo các công thức bằng cách sử dụng phương pháp riêng, vì vậy việc tạo ra thuốc nhuộm thường được giao cho một người. Có nghĩa rằng, cũng có nhiều kỹ thuật viên hơn trong phòng thí nghiệm, vì vậy thời gian cần thiết để chuẩn bị thuốc thử không làm giảm khối lượng công việc chung của nhóm.
![H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practices-img03](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-01/H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practices-img03.jpg?itok=y3lS8Lxb)
Nhiều phòng thí nghiệm nhận thấy kết hợp thuốc nhuộm là cách dễ nhất để đảm bảo chất lượng nhất quán và có thể lặp lại. Nhiều loại kết hợp thuốc nhuộm hematoxylin và eosin mang lại khả năng tùy chỉnh kết quả mong muốn, ít phức tạp. Việc giảm nhân sự khiến việc sử dụng các thuốc thử có sẵn trở nên lý tưởng vì các kỹ thuật viên có thể tập trung tốt hơn vào việc vùi và cắt mô, đây là những lĩnh vực của phòng thí nghiệm cung cấp ít khả năng tự động hóa nhất.
![H-and-E-Staining-Tổng quan-A-Hướng dẫn-thực hành tốt nhất-img04](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-01/H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practices-img04.jpg?itok=cwTsMygE)
Nhuộm Hematoxylin và Eosin được sử dụng trong nhiều lĩnh vực của phòng thí nghiệm mô học, bao gồm sinh thiết tức thì,chọc hút tế bào bằng kim nhỏ FNA và các vùi mô cố định bằng parafin. Để hiểu rõ hơn điều gì tạo nên một lam kính được nhuộm màu tốt, điều quan trọng là phải hiểu các thành phần của thuốc nhuộm
Hematoxylin được sử dụng để minh họa chi tiết nhân trong tế bào. Độ rõ nét của màu không chỉ liên quan đến lượng DNA trong nhân mà còn liên quan đến khoảng thời gian mẫu tồn tại trong hematoxylin.
Hematoxylin là một loại thuốc nhuộm khá đơn giản để thực hiện. Nó được chiết xuất từ cây Haematoxylum campechianum. Quá trình oxy hóa hematoxylin tạo ra hematein, đây là thuốc nhuộm thực sự được sử dụng trong nhuộm H&E. Việc bổ sung chất gắn màu giúp cải thiện khả năng hematein gắn vào các thành phần anion (tích điện âm) của mô.
![H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practice](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-12/H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practices-img05_1.jpg?itok=xAcKy1fc)
Hematoxylin thường được phân loại theo chất gắn màu được sử dụng trước khi nhuộm. Chất gắn màu tăng cường điện tích ion dương của hematin. Điều này hỗ trợ sự liên kết của hematin với thành phần mô anion, mà phổ biến nhất là chất nhiễm sắc. Loại chất gắn màu cũng ảnh hưởng đến màu sắc cuối cùng của các thành phần được nhuộm màu. Chất gắn màu phổ biến nhất được sử dụng trong mô học thông thường là nhôm amoni sulfat (phèn chua). Chất gắn màu này làm cho các hạt nhân có màu đỏ, sau đó chuyển sang màu xanh lam quen thuộc hơn khi mẫu được rửa sau đó bằng dung dịch bazơ yếu.
Mayer’s hematoxylin là một hematoxylin chứa phèn, một chất nhuộm thường được sử dụng có thể được sử dụng cho cả thuốc nhuộm tiến triển và thoái hóa. Nó thường được sử dụng như một chất chống lại hạt nhân cho các thuốc nhuộm đặc biệt và hóa mô miễn dịch. Đối với những ứng dụng này, Mayer’s được sử dụng để nhuộm nhân và sau đó nhuộm xanh mà không cần sử dụng chất phân biệt. Mayer’s là thuốc nhuộm gốc nước.
Harris hematoxylin là một loại hematoxylin phèn có thể được sử dụng để nhuộm liên tục các mẫu tế bào nhưng cũng có thể được sử dụng để nhuộm liên tục hoặc thoái triển trong mô học. Việc nhuộm màu có xu hướng cung cấp chi tiết hạt nhân rõ ràng. Một thách thức khi sử dụng Harris là nó được phân biệt tốt nhất bằng một loại axit nhẹ, trái ngược với các chất phân biệt dựa trên axit clohydric được sử dụng phổ biến hơn. Harris là hoá chất nhuộm một dựa trên rượu. Gill’s hematoxylin là một hematoxylin phèn chua. Nó có thể được sử dụng như một thuốc nhuộm tiến triển hoặc thoái triển và có sẵn ở các nồng độ khác nhau. Bởi vì nó được làm bằng nước và ethylene glycol, quá trình tự oxy hóa thuốc nhuộm thường được ngăn chặn, làm cho nó ổn định hơn so với Harris hematoxylin. Tuy nhiên, bản chất của Gills là có thể xảy ra hiện tượng nhuộm ngoài nhân. Chất nhầy và thậm chí cả chất kết dính được sử dụng trên lam kính có thể bị ô nhiễm với Grills
Các hematoxylin sử dụng muối sắt làm chất gắn màu thường được sử dụng trong các thuốc nhuộm đặc biệt. Điều này là do chúng có thể chứng minh nhiều cấu trúc mô hơn so với hematoxylin trong phèn, chẳng hạn như sợi myelin và elastin. Một trong những loại được biết đến nhiều nhất là Weigert’s, được sử dụng trong Verhoeff-Van Gieson.
![H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practices-img06](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-01/H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practices-img06.jpg?itok=F47yARsp)
Sau khi xem xét các thuốc nhuộm nhân, hãy nói về thuốc nhuộm thành phần tế bào chất. Eosin là hợp chất axit huỳnh quang được sử dụng phổ biến nhất để phân biệt giữa tế bào chất và nhân tế bào. Nó thường có màu hồng, với các sắc độ hồng khác nhau đối với các loại sợi mô liên kết khác nhau.
Eosin Y là dạng eosin được sử dụng phổ biến nhất và có thể được sử dụng trong cả nước và rượu. Việc thêm một lượng nhỏ axit axetic cũng sẽ làm sắc màu eosin. Eosin với phloxine được thêm vào sẽ làm tăng màu đỏ khi nhuộm H&E. Vì vậy, đối với những người muốn nhìn thấy màu đỏ đậm hơn, có thể thêm phloxine vào
![H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practices-img07](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-01/H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practices-img07.jpg?itok=x6ChWWat)
Các hỗn hợp eosin khác đôi khi được sử dụng, chẳng hạn như EA50 và EA65. Những thuốc nhuộm này chủ yếu được sử dụng cho tế bào học, và ngoài eosin Y, bao gồm màu lục nhạt, hơi vàng và nâu Bismarck. Việc bổ sung hai loại thuốc nhuộm này tạo ra sự thay đổi màu sắc từ tế bào chất màu xanh nhạt sang màu hồng, được ghi nhận rõ nhất trong các tế bào vảy của phết tế bào cổ tử cung. Nồng độ của hỗn hợp xác định ký hiệu 50 hoặc 65.
![image_8](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2022-03/image_8.jpg?itok=2C4Pna0X)
Sự khác biệt của vết nhuộm cho phép khả năng loại bỏ có chọn lọc mô theo sở thích của người xem. Trong trường hợp của hematoxylin, axit clohydric (để phân biệt nhanh) và axit axetic (để phân biệt chậm hơn, có kiểm soát hơn) được sử dụng phổ biến nhất. Mặc dù axit clohydric (HCl) trước đây là tiêu chuẩn, nhưng các axit nhẹ hơn đang được sử dụng để loại bỏ thuốc nhuộm nhẹ nhàng hơn. Một phần của xu hướng này là do việc sử dụng nhuộm màu tự động, phải phù hợp với chuyển động của cánh tay rô-bốt bên cạnh thời gian sử dụng thuốc thử.
Thuốc thử tạo màu xanh, chẳng hạn như Scott’s Tap Water, được sử dụng để thay đổi hematoxylin từ màu đỏ sang màu xanh lam truyền thống. Những dung dịch cơ bản này làm thay đổi thuốc nhuộm về mặt hóa học để tạo ra sự thay đổi màu. Ở một số địa điểm, nước máy chứa đủ khoáng chất để độ pH làm cho nước đủ bazơ để cho phép làm xanh nhân mà không cần thuốc thử đặc hiệu làm xanh. Tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp, các phòng thí nghiệm thường thêm bước này để đảm bảo tạo màu xanh thích hợp.
Kết hợp lại, các thành phần này tạo nên nhuộm chuẩn được sử dụng nhiều nhất trong phòng thí nghiệm mô học.
Lựa chọn phương pháp nhuộm H&E
Bước tiếp theo để có vết nhuộm tốt là xác định loại thuốc nhuộm H&E mong muốn.
Nhuộm tiến triển xảy ra khi hematoxylin được thêm vào mô mà không được theo sau bởi chất phân biệt để loại bỏ thuốc nhuộm dư thừa. Do không có bước phân biệt nên hiện tượng nhuộm màu nền có thể xảy ra, đặc biệt là với các tiêu bản đã tích điện hoặc đã xử lý. Các nhà nghiên cứu bệnh học đôi khi thích loại nhuộm này hơn, bởi vì vật liệu phi tế bào, chẳng hạn như chất nhầy, nhuộm bởi hematoxylin. Sự nhuộm màu ngoại bào này có thể là một dấu hiệu của các khối u biệt hóa tốt.
![H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practices-img09](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-01/H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practices-img09.jpg?itok=BOOYdtpk)
Bảng sau đây chứa quy trình nhuộm thoái hoá đơn giản mang lại sự cân bằng tốt giữa nhuộm nhân và tế bào chất. Quy trình này được thiết kế có lưu ý đến chất phân biệt axit nhẹ.
Khi các thành phần nhuộm màu đã được chọn, bạn nên bắt đầu với quy trình cơ sở. Từ đó, chỉnh sửa hematoxylin theo gia số 30 giây HOẶC eosin theo gia số 15 giây. Hãy nhớ rằng, eosin sẽ có xu hướng thẩm thấu nhanh hơn nhiều. Trừ khi có nhu cầu làm sáng hoặc tối đáng kể cường độ nhuộm eosin, các khoảng tăng dần ngắn hơn là tốt nhất. Điều quan trọng nữa là mỗi lần chỉ thay một thuốc nhuộm. Có vẻ như hematoxylin bị nhuộm màu quá mức, trong khi eosin chỉ cần đậm đặc hơn.
Khi các phòng thí nghiệm tiếp tục phát triển, nhu cầu về kết quả nhất quán và thông lượng liên tục là rất cần thiết. Khả năng tái tạo là một phần quan trọng của chất lượng thuốc nhuộm trong phòng thí nghiệm. Khi nhuộm bằng tay, các biến số của con người có thể làm cho mỗi tiêu bản màu trông khác hơn. Việc bổ sung tự động hóa không chỉ loại bỏ khả năng xảy ra sự không nhất quán mà còn giải phóng các nhà công nghệ để thực hiện các nhiệm vụ khác trong phòng thí nghiệm.
Điều quan trọng là đạt được sự cân bằng hợp lý của thuốc nhuộm. Nhuộm quá nhiều bằng hematoxylin có thể tạo ảo giác eosin không bền màu, cũng giống như việc nhuộm quá nhiều eosin có thể khiến hematoxylin có vẻ nhẹ hơn so với thực tế. Vì vậy, khi tối ưu hóa thuốc nhuộm, hãy đảm bảo chỉ chỉnh sửa thời gian của một trong các thành phần. Kỹ thuật này sẽ giúp loại bỏ nhu cầu dành thêm thời gian để điều chỉnh vết nhuộm
Xylen | 2 phút |
Xylen | 2 phút |
100% etanol | 2 phút |
100% etanol | 2 phút |
95% etanol | 2 phút |
Rửa bằng nước | 2 phút |
hematoxylin | 3 phút |
Rửa bằng nước | 1 phút |
Chất phân biệt (axit nhẹ) | 1 phút |
Rửa bằng nước | 1 phút |
làm xanh | 1 phút |
Rửa bằng nước | 1 phút |
95% etanol | 1 phút |
eosin | 45 giây |
95% etanol | 1 phút |
100% etanol | 1 phút |
100% etanol | 1 phút |
Xylen | 2 phút |
Xylen | 2 phút |
lớp phủ |
![H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practices-img10](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-01/H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practices-img10.jpg?itok=YJS8RsYD)
![H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practices-img11](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-01/H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practices-img11.jpg?itok=7AjI8QoV)
Với nhuộm tiến triển có sửa đổi, một bộ phân biệt được sử dụng. Nếu sự khác biệt được tạo ra, thì có khả năng nó quá yếu hoặc quá mạnh. Cả hai kịch bản sẽ ảnh hưởng đến nhuộm màu. Nếu chất phân biệt mạnh hơn dự định, nó sẽ loại bỏ nhiều hematoxylin hơn và sẽ làm cho nhân nhạt màu. Thời gian cũng rất quan trọng. Quá nhiều thời gian trong bộ phân biệt được chuẩn bị đúng cách cũng sẽ loại bỏ nhiều hematoxylin hơn và cuối cùng sẽ làm bền nhân.
Độ axit nhẹ rất quan trọng đối với thời hạn sử dụng của hematoxylin. Nếu không có nó, độ kiềm của tap water rinse sẽ làm tăng độ pH khiến thuốc nhuộm có thể kết tủa và màu sẽ chuyển từ đỏ anh đào sang đỏ tím. Định kỳ thêm một lượng nhỏ axit axetic vào hematoxylin sẽ giúp duy trì độ pH thích hợp và có thể kéo dài tuổi thọ của vết nhuộm
Nước được sử dụng như một chất phân biệt cho eosin. Người ta thường thực hiện bước eosin với ethanol 95%. Ethanol hỗ trợ làm sạch lam kính, trong khi nước đẩy eosin dư thừa ra khỏi mô. Bước này có thể giúp kiểm soát màu nhưng kéo dài thời gian sẽ tạo ra các vết nhuộm nhẹ hơn, trong khi rút ngắn thời gian sẽ duy trì màu sáng hơn. Tuy nhiên, lượng nước dư thừa trong xylene có thể tiếp tục quá trình phân biệt và có thể được nhìn thấy sau khi phủ tiêu bản dưới dạng sương mù màu hồng trên lam kính
Không phải tất cả các mô đều được tạo ra như nhau. Các mẫu u nang và chất béo, ngay cả khi được xử lý đúng cách, có thể rất khó nhìn rõ sau khi lam kính đã được nhuộm màu. Những mẫu này thường có các khoảng trống nơi có chất lỏng hoặc chất béo trong tế bào và độ mỏng của thành tế bào có thể tạo ra tế bào sáng hơn.
Các mẫu có nhiều tế bào (ví dụ amidan, hạch bạch huyết) có thể rất đáng lo ngại. Các tế bào lympho có ít tế bào chất và hầu như không có vật liệu tế bào giữa các tế bào như với các mô khác. Vì lý do này, hematoxylin không phải cạnh tranh với eosin. Bản chất của các tế bào cũng tập trung DNA, làm cho các mô có tính tế bào cao này trông giống như bị quá tải, trong khi thực tế, chúng có thể chỉ cần được cắt mỏng hơn.
![H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practices-img12](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-01/H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practices-img12.jpg?itok=z7w19kpJ)
![H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practices-img13](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-01/H-and-E-Staining-Overview-A-Guide-to-Best-Practices-img13.jpg?itok=QPoR7k-7)
Cách đơn giản nhất để ngăn điều này xảy ra là thay thuốc thử thường xuyên hơn. Thêm một lượng nhỏ hạt hút ẩm (khoảng một muỗng canh cho mỗi bình thuốc thử) cũng sẽ làm giảm ô nhiễm nước trong dung môi. Các biện pháp này đặc biệt quan trọng khi sử dụng chất thay thế xylene, vì các thuốc thử này có xu hướng chịu sự ô nhiễm nước ít hơn nhiều so với xylene.
Hướng dẫn thực hiện nhuộm H&E
Nhuộm hematoxylin và eosin (H&E) được sử dụng rộng rãi nhất trong các phòng thí nghiệm mô học và mô bệnh học. Khi nó được thực hiện đúng cách, nó có khả năng chứng minh một loạt các thành phần mô và tế bào bình thường và nhiễm bệnh, tuy nhiên nó là một vết nhuộm tương đối đơn giản để thực hiện trên các phần parafin hoặc đông lạnh. Về mô bệnh học, một tỷ lệ cao các trường hợp có thể được chẩn đoán bởi một nhà nghiên cứu bệnh học có kinh nghiệm chỉ sử dụng nhuộm H&E.
Một số lượng nhỏ tiêu bản có thể được nhuộm thủ công một cách hiệu quả, trong khi ở các phòng thí nghiệm có năng suất cao, quá trình nhuộm có thể được thực hiện thành công và nhất quán bằng cách sử dụng máy nhuộm tiêu bản tự động.
Có một số công thức hematoxylin và eosin khác nhau được sử dụng phổ biến, mỗi công thức có những ưu điểm và nhược điểm khác nhau. Một số phòng thí nghiệm thích chuẩn bị các giải pháp của riêng họ trong khi những phòng thí nghiệm khác chọn các sản phẩm thương mại sẵn sàng sử dụng.
Giới thiệu
Nhuộm H&E cung cấp giải pháp toàn diện về vi giải phẫu của các cơ quan và mô. Hematoxylin nhuộm chính xác các thành phần nhân, bao gồm heterochromatin và nucleoli, trong khi eosin nhuộm các thành phần tế bào chất bao gồm collagen và sợi đàn hồi , sợi cơ và hồng cầu. Trong nhuộm H&E chất lượng cao, có sự khác biệt về sắc thái màu do vết nhuộm tạo ra, đặc biệt là eosin, và điều này hỗ trợ trong việc phát hiện và giải thích các thay đổi hình thái liên quan đến bệnh.
Điều quan trọng là những người thực hiện và đánh giá chất lượng vết nhuộm H&E yêu cầu phải có kinh nghiệm, vết nhuộm được thực hiện đúng cách với thuốc thử chất lượng cao và nhận ra những phát hiện để soi dưới kính hiển vi. Việc duy trì nhuộm H&E nhất quán, chất lượng cao là một yêu cầu cơ bản trong các phòng thí nghiệm mô bệnh học.
Trong các phần sau đây, các bước cơ bản trong việc thực hiện nhuộm H&E.
Khử sáp parafin
Sau khi chuẩn bị phần parafin, tất cả các nguyên tố được thấm và bao quanh bởi sáp parafin kỵ nước và không thấm nước đối với thuốc thử. Phần lớn các thành phần tế bào và mô không có màu sắc tự nhiên và không nhìn thấy được. Bước đầu tiên khi thực hiện nhuộm H&E là hòa tan tất cả sáp bằng xylene (một dung môi hydrocarbon).
Khử nước
Sau khi loại bỏ sáp, lam kính được đưa qua vài lần thay cồn để loại bỏ xylen, sau đó rửa kỹ bằng nước. Phần này phải được khử nước để thuốc thử dạng nước dễ dàng xâm nhập vào các tế bào và các thành phần mô.
Áp dụng thuốc nhuộm nhân Hematoxylin
Hiện tại, lam kính được nhuộm bằng thuốc nhuộm nhân như Harris hematoxylin, bao gồm thuốc nhuộm (hematoxylin hoặc hematein bị oxy hóa) và chất gắn màu hoặc chất gắn kết (muối nhôm) trong dung dịch. Chúng sử dụng để nhuộm các nhân và một số nguyên tố khác thành màu tím đỏ.
Thực hiện nhuộm nhân bằng cách “Nhuộm xanh”
Sau khi làm sạch, phần này được “nhuộm xanh” bằng cách xử lý bằng dung dịch kiềm yếu. Bước này chuyển đổi hematoxylin thành màu xanh đậm. Sau đó, kiểm tra xem các nhân có được nhuộm đúng cách hay không, hiển thị độ tương phản đầy đủ và để đánh giá mức độ nhuộm nền.
Loại bỏ chất nền dư thừa
Trong hầu hết các trường hợp khi Harris hematoxylin được sử dụng, cần có bước phân biệt (nhuộm màu) để loại bỏ chất nền không đặc hiệu và cải thiện độ tương phản. Một rượu axit yếu được sử dụng. Sau quá trình xử lý này, cần phải nhuộm xanh và làm sạch. Các phương pháp nhuộm màu bao gồm bước nhuộm màu hoặc phân biệt được gọi là các phương pháp nhuộm “thoái hoá”.
Áp dụng hợp chất axit huỳnh quang Eosin
Phần này bây giờ được nhuộm bằng dung dịch eosin trong nước hoặc cồn (tùy thuộc vào sở thích cá nhân). Điều này tô màu nhiều yếu tố phi hạt nhân trong các sắc thái khác nhau của màu hồng.
Phương pháp dán lam
Sau khi nhuộm eosin, lam kính được chuyển qua một số lần thay cồn để loại bỏ tất cả dấu vết của nước, sau đó được làm sạch trong nhiều bể xylen để “làm sạch” mô và làm cho nó hoàn toàn trong suốt. Một lớp chất kết dính polystyrene mỏng được phủ lên, tiếp theo là một lớp kính phủ. Nếu quy trình nhuộm và tất cả các bước tiếp theo được thực hiện đúng cách, tiêu bản sẽ cho biết tất cả các thành phần vi mô quan trọng và ổn định trong nhiều năm.
Khắc phục sự cố khi nhuộm H&E
Mặc dù H&E là một vết nhuộm tương đối đơn giản để thực hiện, nhưng vẫn có rất nhiều thành phần có thể khắc phục được
Các bước để Nhuộm H&E tốt hơn + Dán lam
Từ bệnh nhân đến nhà nghiên cứu bệnh học, việc chuẩn bị các mẫu mô để kiểm tra mô học đòi hỏi sự cẩn thận, kỹ năng và quy trình hợp lý. Dưới đây là những kỹ thuật thực hành tốt nhất và các cách đơn giản để tránh các lỗi phổ biến.
Sử dụng thời gian chính xác
Mỗi bước trong quy trình nhuộm màu đều được tính thời gian chính xác.
![Bước_52_biến_staining_3](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-01/Step_52_variable_staining_3.jpg?itok=9CTyHQvM)
Các phần này được cắt từ cùng một khối với cùng độ dày và nhuộm H&E thủ công bởi các nhân viên khác nhau bằng cách sử dụng cùng một phương pháp.
Thường xuyên theo dõi chất lượng
Tiêu bản được nhuộm thường xuyên để theo dõi chất lượng nhuộm.
![Bước_53_Kidney_H_E_Good_std](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-01/Step_53_Kidney_H_E_Good_std.jpg?itok=MzHl781i)
Phần này của thận bao gồm nhiều yếu tố mô bạch cầu ái toan và nhân được bảo quản tốt cho phép đánh giá đáng tin cậy về chất lượng nhuộm H&E. Nhau thai là một loại mẫu vật khác có thể được sử dụng như một biện pháp kiểm soát hữu ích.
Chuẩn hóa các điều kiện nhuộm
Thời gian khuấy trộn, làm sạch được tối ưu hóa cho tất cả các bước trong quá trình nhuộm màu.
![Bước_54_vision_bio_systems_24.5](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-01/Step_54_vision_bio_systems_24.5.jpg?itok=eQ7P05WQ)
Một trong những lợi ích của việc sử dụng dụng cụ nhuộm màu tự động là thời gian khuấy trộn, làm sạch đều nhất quán. Cung cấp các biến khác được kiểm soát đúng cách, điều này sẽ đảm bảo kết quả tốt, nhất quán.
Đảm bảo làm mờ hoàn toàn
Làm mờ tiêu bản được tối ưu hóa.
![Bước_55_Gut_H_E_residual_wax_x10](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-01/Step_55_Gut_H_E_residual_wax_x10.jpg?itok=R0DKjKHH)
Phần nhuộm H&E này cho thấy một vùng lớn không nhuộm màu ở bên trái và một số vùng nhỏ hơn bị nhuộm màu một phần hoặc không nhuộm màu. Điều này là do loại bỏ sáp không hoàn toàn trước khi nhuộm.
Thay mới thuốc thử thường xuyên
Dung môi và thuốc nhuộm nhuộm được thay thế thường xuyên dựa trên số lượng tiêu bản được nhuộm hoặc giá đỡ được xử lý.
![Bước_56_Muddy_Haematoxylin_Skin_X40](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-01/Step_56_Muddy_Haematoxylin_Skin_X40.jpg?itok=-OJEnqEA)
Phần này cho thấy nhuộm hematoxylin chất lượng kém, bùn. Thuốc thử này nên được thay thế ngay lập tức.
Khử nước triệt để
Các lam kính được khử hoàn toàn trước khi nhuộm hematoxylin.
![Bước_57_Hydrate_Sections_Throughly](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-01/Step_57_Hydrate_Sections_Thoroughly.jpg?itok=xIa4FeDW)
Màu hematoxylin không đồng đều có thể nhìn thấy trong lớp biểu bì ở phần da này là do xylene còn sót lại (sáp) có mặt khi sử dụng hematoxylin.
Theo dõi chất lượng Hematoxylin
Hiệu suất của các giải pháp hematoxylin được theo dõi cẩn thận. Trong thời gian làm việc, các dung dịch hematoxylin được pha loãng dần do mang từ các lam kính và giá đỡ và cũng bị ảnh hưởng bởi quá trình oxy hóa liên tục.
![Bước_58_Monitor_Hematoxylin_Quality](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-01/Step_58_Monitor_Hematoxylin_Quality.jpg?itok=6p6ISlxL)
Hai tiêu bản từ cùng một khối điều khiển được hiển thị. Chúng được nhuộm H&E bằng cách sử dụng các giao thức giống hệt nhau trên máy nhuộm tự động. Ngay cả về mặt vĩ mô, sự thay đổi về mức độ nhuộm màu là rõ ràng.
Đảm bảo “Nhuộm xanh” nhân hoàn chỉnh
Quá trình “nhuộm xanh” nhân hoàn toàn bằng chất thay thế nước có tính kiềm của Scott hoặc nước amoniac luôn được thực hiện sau khi nhuộm hematoxylin. Yêu cầu này bị ảnh hưởng bởi độ pH tự nhiên của nước tại địa phương
![Đảm bảo nhuộm xanh hoàn toàn hạt nhân A](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-07/Ensure-Complete-Nuclear-Blueing-A.jpg?itok=Rjm0Gge9)
A. Trong phần này, nhân biểu bì kém xác định và có màu hơi hồng. Phần này không được “nhuộm xanh” đúng cách trong nước kiềm sau khi nhuộm hematoxylin (da, H&E)
![Đảm bảo làm xanh hoàn toàn hạt nhân B](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-07/Ensure-Complete-Nuclear-Blueing-B.jpg?itok=5oagSBzk)
B. Điều này cho thấy một phần khác đã được “làm mờ” đúng cách sau nhuộm nhân. Ở đây, các hạt nhân được xác định rõ hơn nhiều (da, H&E).
Tránh nhuộm Eosin không đều
Sau quá trình “nhuộm xanh” là làm sạch để loại bỏ chất kiềm còn sót lại có thể cản trở quá trình nhuộm màu eosin và gây ra màu nhuộm yếu và không đều.
![Nhuộm Hematoxylin và Eosin](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-01/Step_60_Avoid_Uneven_Eosin_Staining.jpg?itok=jBrTUHYB)
Phần này trình bày tác dụng của kiềm dư đối với nhuộm eosin. Lưu ý tính chất loang lổ của vết nhuộm (lách, H&E).
Theo dõi pH Eosin
Độ pH của dung dịch eosin được theo dõi. Nó được giữ gần với độ pH 5.0 để duy trì sự nhuộm màu tối ưu. Việc thêm một vài giọt axit axetic có thể được sử dụng như một phương tiện thuận tiện để giảm độ pH.
![Bước_61_Monitor_Eosin_pH](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-01/Step_61_Monitor_Eosin_pH.jpg?itok=Bm7m0qgU)
Một phần phổi nhuộm H&E. Vết eosin rất yếu và không thể chấp nhận được. Lưu ý rằng các thành phần duy nhất được nhuộm bằng eosin là các tế bào hồng cầu.
Khử nước triệt để trước khi làm sạch và che phủ
Các phần được khử nước hoàn toàn trước khi cho vào xylene để làm sạch.
![Bước_62_Throughly_Dehydrate_ Before_Clearing_and_Coverslipping](https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/styles/720_tablet_portrait_fallback/public/media_image-file/2021-01/Step_62_Thoroughly_Dehydrate_Before_Clearing_and_Coverslipping.jpg?itok=asnaFzMm)
Phần này không rõ ràng (có vẻ mờ đục khi nhìn bằng mắt thường). Kiểm tra cẩn thận cho thấy những giọt nước nhỏ xuất hiện khắp nơi
Tránh làm khô và hình thành tinh thể
Lớp phủ luôn được áp dụng trước khi phần có cơ hội khô và sử dụng chất gắn kết chất lượng cao. Chất lượng bảo quản lâu dài của chất gắn kết phải được biết vì các tinh thể có thể xuất hiện trong chất gắn chất lượng kém, đôi khi sau một thời gian dài (tháng hoặc năm).
A. Phần này được để khô một phần trước khi phủ lên. Điều này khiến cho các bong bóng khí nhỏ bị mắc kẹt trên một số hạt nhân làm cho chúng có màu đen (đôi khi được gọi là “vảy ngô”). B. Một phần bị phủ được nhuộm H&E cho thấy vô số tinh thể hình cầu khúc xạ phát triển từ chất gắn kém chất lượng trong vòng sáu tháng sau khi gắn.
Nguồn: https://www.leicabiosystems.com/knowledge-pathway/he-staining-overview-a-guide-to-best-practices/
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các thiết bị Giải phẫu bệnh từ hãng Leica Biosystems.