Nhuộm Hematoxylin và Eosin (H&E) – Những cách để thực hiện nhuộm mô hiệu quả nhất

Nhiều phòng thí nghiệm nhận thấy kết hợp thuốc nhuộm là cách dễ nhất để đảm bảo chất lượng nhất quán và có thể lặp lại. Nhiều loại kết hợp thuốc nhuộm hematoxylin và eosin mang lại khả năng tùy chỉnh kết quả mong muốn, ít phức tạp. Việc giảm nhân sự khiến việc sử dụng các thuốc thử có sẵn trở nên lý tưởng vì các kỹ thuật viên có thể tập trung tốt hơn vào việc vùi và cắt mô, đây là những lĩnh vực của phòng thí nghiệm cung cấp ít khả năng tự động hóa nhất.

Nhuộm Hematoxylin và Eosin được sử dụng trong nhiều lĩnh vực của phòng thí nghiệm mô học, bao gồm sinh thiết tức thì,chọc hút tế bào bằng kim nhỏ FNA và các vùi mô cố định bằng parafin. Để hiểu rõ hơn điều gì tạo nên một lam kính được nhuộm màu tốt, điều quan trọng là phải hiểu các thành phần của thuốc nhuộm

Hematoxylin được sử dụng để minh họa chi tiết nhân trong tế bào. Độ rõ nét của màu không chỉ liên quan đến lượng DNA trong nhân mà còn liên quan đến khoảng thời gian mẫu tồn tại trong hematoxylin.

Hematoxylin là một loại thuốc nhuộm khá đơn giản để thực hiện. Nó được chiết xuất từ ​​cây Haematoxylum campechianum. Quá trình oxy hóa hematoxylin tạo ra hematein, đây là thuốc nhuộm thực sự được sử dụng trong nhuộm H&E. Việc bổ sung chất gắn màu giúp cải thiện khả năng hematein gắn vào các thành phần anion (tích điện âm) của mô.

Sau khi xem xét các thuốc nhuộm nhân, hãy nói về thuốc nhuộm thành phần tế bào chất. Eosin là hợp chất axit huỳnh quang được sử dụng phổ biến nhất để phân biệt giữa tế bào chất và nhân tế bào. Nó thường có màu hồng, với các sắc độ hồng khác nhau đối với các loại sợi mô liên kết khác nhau.

Eosin Y là dạng eosin được sử dụng phổ biến nhất và có thể được sử dụng trong cả nước và rượu. Việc thêm một lượng nhỏ axit axetic cũng sẽ làm sắc màu eosin. Eosin với phloxine được thêm vào sẽ làm tăng màu đỏ khi nhuộm H&E. Vì vậy, đối với những người muốn nhìn thấy màu đỏ đậm hơn, có thể thêm phloxine vào

Sự khác biệt của vết nhuộm cho phép khả năng loại bỏ có chọn lọc mô theo sở thích của người xem. Trong trường hợp của hematoxylin, axit clohydric (để phân biệt nhanh) và axit axetic (để phân biệt chậm hơn, có kiểm soát hơn) được sử dụng phổ biến nhất. Mặc dù axit clohydric (HCl) trước đây là tiêu chuẩn, nhưng các axit nhẹ hơn đang được sử dụng để loại bỏ thuốc nhuộm nhẹ nhàng hơn. Một phần của xu hướng này là do việc sử dụng nhuộm màu tự động, phải phù hợp với chuyển động của cánh tay rô-bốt bên cạnh thời gian sử dụng thuốc thử.

Thuốc thử tạo màu xanh, chẳng hạn như Scott’s Tap Water, được sử dụng để thay đổi hematoxylin từ màu đỏ sang màu xanh lam truyền thống. Những dung dịch cơ bản này làm thay đổi thuốc nhuộm về mặt hóa học để tạo ra sự thay đổi màu. Ở một số địa điểm, nước máy chứa đủ khoáng chất để độ pH làm cho nước đủ bazơ để cho phép làm xanh nhân mà không cần thuốc thử đặc hiệu làm xanh. Tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp, các phòng thí nghiệm thường thêm bước này để đảm bảo tạo màu xanh thích hợp.

Kết hợp lại, các thành phần này tạo nên nhuộm chuẩn được sử dụng nhiều nhất trong phòng thí nghiệm mô học.

Bước tiếp theo để có vết nhuộm tốt là xác định loại thuốc nhuộm H&E mong muốn.

Nhuộm tiến triển xảy ra khi hematoxylin được thêm vào mô mà không được theo sau bởi chất phân biệt để loại bỏ thuốc nhuộm dư thừa. Do không có bước phân biệt nên hiện tượng nhuộm màu nền có thể xảy ra, đặc biệt là với các tiêu bản đã tích điện hoặc đã xử lý. Các nhà nghiên cứu bệnh học đôi khi thích loại nhuộm này hơn, bởi vì vật liệu phi tế bào, chẳng hạn như chất nhầy, nhuộm bởi hematoxylin. Sự nhuộm màu ngoại bào này có thể là một dấu hiệu của các khối u biệt hóa tốt.

Bảng sau đây chứa quy trình nhuộm thoái hoá đơn giản mang lại sự cân bằng tốt giữa nhuộm nhân và tế bào chất. Quy trình này được thiết kế có lưu ý đến chất phân biệt axit nhẹ.

Khi các thành phần nhuộm màu đã được chọn, bạn nên bắt đầu với quy trình cơ sở. Từ đó, chỉnh sửa hematoxylin theo gia số 30 giây HOẶC eosin theo gia số 15 giây. Hãy nhớ rằng, eosin sẽ có xu hướng thẩm thấu nhanh hơn nhiều. Trừ khi có nhu cầu làm sáng hoặc tối đáng kể cường độ nhuộm eosin, các khoảng tăng dần ngắn hơn là tốt nhất. Điều quan trọng nữa là mỗi lần chỉ thay một thuốc nhuộm. Có vẻ như hematoxylin bị nhuộm màu quá mức, trong khi eosin chỉ cần đậm đặc hơn.

Khi các phòng thí nghiệm tiếp tục phát triển, nhu cầu về kết quả nhất quán và thông lượng liên tục là rất cần thiết. Khả năng tái tạo là một phần quan trọng của chất lượng thuốc nhuộm trong phòng thí nghiệm. Khi nhuộm bằng tay, các biến số của con người có thể làm cho mỗi tiêu bản màu trông khác hơn. Việc bổ sung tự động hóa không chỉ loại bỏ khả năng xảy ra sự không nhất quán mà còn giải phóng các nhà công nghệ để thực hiện các nhiệm vụ khác trong phòng thí nghiệm.

Điều quan trọng là đạt được sự cân bằng hợp lý của thuốc nhuộm. Nhuộm quá nhiều bằng hematoxylin có thể tạo ảo giác eosin không bền màu, cũng giống như việc nhuộm quá nhiều eosin có thể khiến hematoxylin có vẻ nhẹ hơn so với thực tế. Vì vậy, khi tối ưu hóa thuốc nhuộm, hãy đảm bảo chỉ chỉnh sửa thời gian của một trong các thành phần. Kỹ thuật này sẽ giúp loại bỏ nhu cầu dành thêm thời gian để điều chỉnh vết nhuộm

Với nhuộm tiến triển có sửa đổi, một bộ phân biệt được sử dụng. Nếu sự khác biệt được tạo ra, thì có khả năng nó quá yếu hoặc quá mạnh. Cả hai kịch bản sẽ ảnh hưởng đến nhuộm màu. Nếu chất phân biệt mạnh hơn dự định, nó sẽ loại bỏ nhiều hematoxylin hơn và sẽ làm cho nhân nhạt màu. Thời gian cũng rất quan trọng. Quá nhiều thời gian trong bộ phân biệt được chuẩn bị đúng cách cũng sẽ loại bỏ nhiều hematoxylin hơn và cuối cùng sẽ làm bền nhân.

Độ axit nhẹ rất quan trọng đối với thời hạn sử dụng của hematoxylin. Nếu không có nó, độ kiềm của tap water rinse sẽ làm tăng độ pH khiến thuốc nhuộm có thể kết tủa và màu sẽ chuyển từ đỏ anh đào sang đỏ tím. Định kỳ thêm một lượng nhỏ axit axetic vào hematoxylin sẽ giúp duy trì độ pH thích hợp và có thể kéo dài tuổi thọ của vết nhuộm

Nước được sử dụng như một chất phân biệt cho eosin. Người ta thường thực hiện bước eosin với ethanol 95%. Ethanol hỗ trợ làm sạch lam kính, trong khi nước đẩy eosin dư thừa ra khỏi mô. Bước này có thể giúp kiểm soát màu nhưng kéo dài thời gian sẽ tạo ra các vết nhuộm nhẹ hơn, trong khi rút ngắn thời gian sẽ duy trì màu sáng hơn. Tuy nhiên, lượng nước dư thừa trong xylene có thể tiếp tục quá trình phân biệt và có thể được nhìn thấy sau khi phủ tiêu bản dưới dạng sương mù màu hồng trên lam kính

Không phải tất cả các mô đều được tạo ra như nhau. Các mẫu u nang và chất béo, ngay cả khi được xử lý đúng cách, có thể rất khó nhìn rõ sau khi lam kính đã được nhuộm màu. Những mẫu này thường có các khoảng trống nơi có chất lỏng hoặc chất béo trong tế bào và độ mỏng của thành tế bào có thể tạo ra tế bào sáng hơn.

Các mẫu có nhiều tế bào (ví dụ amidan, hạch bạch huyết) có thể rất đáng lo ngại. Các tế bào lympho có ít tế bào chất và hầu như không có vật liệu tế bào giữa các tế bào như với các mô khác. Vì lý do này, hematoxylin không phải cạnh tranh với eosin. Bản chất của các tế bào cũng tập trung DNA, làm cho các mô có tính tế bào cao này trông giống như bị quá tải, trong khi thực tế, chúng có thể chỉ cần được cắt mỏng hơn.