Kỹ thuật Cryo-EM cho phân tích protein màng ở 200 keV

Chụp ảnh ở mức điện áp tăng tốc electron thấp hơn

Chụp ảnh bằng cryo-TEM cao cấp hoạt động ở 300 keV, chẳng hạn như “Titan Krios” (Thermo Fisher Scientific) và “CRYO ARM 300” (JEOL Ltd), là công nghệ tiên tiến hiện tại để xác định cấu trúc có độ phân giải cao của các đại phân tử sinh học . Chúng có thể đạt được độ phân giải nguyên tử của các mẫu sinh học, như được thể hiện bằng việc tái tạo apoferritin ở chuột và người ở độ phân giải 1,22 và 1,25 Å, được thực hiện bởi hai nhóm độc lập vào năm 2020. Cấu trúc có độ phân giải cao nhất đạt được cho một protein màng bằng phương pháp cryo-EM cho đến nay là của thụ thể β3-GABAA của người trong phức hợp với megabody trong các đĩa lipid với độ phân giải 1.7 Å. Trong khi các thiết bị hàng đầu này cung cấp thiết lập tốt nhất hiện tại và là lựa chọn đầu tiên để thu thập dữ liệu có độ phân giải cao, chúng có giá thành cao khi mua, lắp đặt, vận hành và bảo trì. Những thiết lập hiện đại này có thể được tiếp cận thông qua nhiều cơ sở cryo-EM quốc gia hoặc hợp tác, trong một số trường hợp không mất phí đối với người dùng học thuật, nhưng thời gian truy cập thường bị hạn chế. Hơn nữa, cần phải có một số vòng tối ưu hóa mẫu để xác định các điều kiện tối ưu trước khi được coi là phù hợp để thu thập dữ liệu có độ phân giải cao.

Một giải pháp thay thế cho các thiết bị 300 kV là các cryo-TEM 200 kV trên thị trường, cụ thể là “Talos Arctica” và “Glacios” (Thermo Fisher Scientific) và “CRYO ARM 200” (JEOL Ltd.), được trang bị súng phát xạ trường (FEG), bộ nạp tự động và máy dò electron trực tiếp. Các thiết bị này có giá cả phải chăng hơn do yêu cầu về cơ sở hạ tầng được nới lỏng và chi phí mua sắm và bảo trì thấp hơn, đi kèm với một số nhược điểm nhưng cũng có lợi ích. Các thiết bị này thường có độ chân không kém hơn; thiếu bộ hiệu chỉnh quang sai cầu; cho thấy độ ổn định quang học kém hơn do chỉ có các thấu kính vật kính có công suất không đổi so với công suất không đổi trên tất cả các thấu kính có trong các thiết bị 300 kV; và các máy dò electron trực tiếp hiện có đã được tối ưu hóa cho 300 keV và hoạt động kém hơn ở điện áp gia tốc thấp hơn. Hơn nữa, nhiều yếu tố có thể hạn chế việc thu thập và thông lượng dữ liệu, chẳng hạn như: i) thiếu thấu kính tụ quang thứ ba hoặc thứ tư, hạn chế phạm vi chiếu sáng song song, cản trở việc thu thập nhiều vùng trên mỗi lỗ có hoặc chiếu sáng nhưng không tạo ra các dải sáng; ii) sự di chuyển của bàn soi trong quá trình sử dụng, có thể làm tăng đáng kể thời gian chờ cần thiết sau khi di chuyển; iii) tiết diện không đàn hồi cao hơn ở điện áp thấp hơn giới hạn độ dày mẫu mà các electron có thể xuyên qua, tuy nhiên, đây hiếm khi là vấn đề đối với các nghiên cứu hạt đơn lẻ. Cuối cùng, giới hạn thông tin độ phân giải trên lý thuyết giảm theo điện áp tăng tốc electron. Tuy nhiên, việc chụp ảnh ở điện áp gia tốc thấp hơn được hưởng lợi từ độ tương phản hình ảnh cao hơn, do các sự kiện tán xạ đàn hồi lớn hơn và giá trị lớn hơn của hàm truyền độ tương phản ở tần số không gian thấp. Một nghiên cứu có hệ thống về mối quan hệ giữa sự phụ thuộc năng lượng của độ tương phản và phá hủy do bức xạ đã định lượng những lợi thế của việc chụp ảnh ở điện áp gia tốc thấp hơn, cho thấy lượng thông tin hữu ích sẽ lớn hơn khoảng 25% ở 100 keV so với 300 keV. Một số chiến lược có thể được triển khai để khắc phục một số điểm yếu liên quan khi chụp ảnh các thiết bị 200 kV, bao gồm: i) sử dụng dịch chuyển hình ảnh chùm tia trong quá trình thu thập dữ liệu để cải thiện thông lượng, và ii) việc sử dụng các thuật toán tính toán để mô hình hóa và hiệu chỉnh các quang sai bậc cao nổi bật hơn ở điện áp gia tốc thấp hơn. Gần đây, người ta đã chứng minh được rằng về nguyên tắc, một TEM 200 kV có thể theo kịp một thiết bị 300 kV về phương diện tốc độ.

Xác định cấu trúc của protein màng ở 200 keV

Các tác giả đã biên soạn một danh sách toàn diện để cung cấp cái nhìn tổng quan về việc sử dụng thành công cryo-TEM điện áp thấp để xác định cấu trúc của protein màng. Nó bao gồm tất cả các bản tái tạo protein màng có độ phân giải tốt hơn 5 Å, được thu được bằng cryo-TEM 200 kV và được báo cáo trong EMDB cho đến cuối năm 2021. Tổng cộng có 158 mục được bổ sung thông tin mở rộng, bao gồm thông tin chi tiết về protein, chuẩn bị mẫu, thu thập dữ liệu, thông số tái tạo và các ghi chú liên quan khác.

Việc tái tạo độ phân giải cao đầu tiên của một protein màng được xác định bằng cryo-EM hạt đơn ở 200 keV là tái tạo chất vận chuyển axit amin trung tính của con người ASCT2 (∼170 kDa dưới dạng trimer) được ngâm trong micelle chất tẩy rửa ở độ phân giải 3,8 Å vào năm 2018 (Hình 1b). Kể từ đó, số lượng protein màng tái tạo và độ phân giải trung bình thu được ở 200 keV đã tăng đều đặn (Hình 1b và c). Rào cản 3 Å với cryo-TEM 200 kV lần đầu tiên đạt được vào năm 2020 với cấu trúc của STEAP1 được ngâm trong micelle chất tẩy rửa và phức hợp với Fab (tổng cộng ∼270 kDa dưới dạng trimer) ở độ phân giải 2,97 Å (Hình 1b), và thực sự vượt qua trong cùng năm với kênh ion SARS-CoV-2 3a (∼62 kDa dưới dạng dimer) trong đĩa nano lipid ở độ phân giải 2,9 Å (Hình 1b). Đáng chú ý, trong cùng ấn phẩm, các tác giả đã có thể phân giải cấu trúc ở độ phân giải 2,1 Å, sử dụng thiết lập kính hiển vi mới nhất, cụ thể là “Titan Krios G4” được trang bị FEG lạnh vượt trội và bộ lọc năng lượng “Selectris-X” và máy dò electron trực tiếp “Falcon 4” (tất cả đều từ Thermo Fisher Scientific). Thành tích dưới 3 Å tương tự ở 200 keV đã đạt được một năm sau đó vào năm 2021 đối với một protein màng không đối xứng có chất vận chuyển ECF đặc hiệu folate (ECF-FolT2) từ Lactobacillus delbrueckii (∼112 kDa) trong các đĩa nano lipid ở độ phân giải 2,7 Å (Hình 1b). Kể từ đó, độ phân giải có thể đạt được đối với protein màng trên cryo-TEM 200 kV đã được đẩy xa hơn nữa lên độ phân giải 2,45 Å với phức hợp thụ thể G-protein liên quan đến Mas của con người X2 (MRGPRX2)-G_q (∼138 kDa) được ngâm trong micelle chất tẩy rửa (Hình 1b). Đáng ngạc nhiên là trong các ấn phẩm liên tiếp, việc tái tạo cùng một thụ thể chỉ đạt độ phân giải 2,8 Å với cryo-TEM 300 kV. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng cả hai nghiên cứu đều không cho phép so sánh rõ ràng, vì chúng hơi khác nhau về thành phần phức tạp, chuẩn bị mẫu và chiến lược xử lý hình ảnh . Tuy nhiên, các nghiên cứu này minh họa rằng cryo-EM ở 200 keV có thể là giải pháp thay thế khả thi cho 300 keV và cũng phù hợp cho các dự án phát triển thuốc dựa trên cấu trúc .

Phần lớn các cấu trúc cryo-EM 200 keV thu được bằng “Talos Arctica” (Thermo Fisher Scientific) kết hợp với máy dò điện tử trực tiếp “K2” hoặc “K3” (Gatan) (Hình 1d-e), có thể là sự phản ánh của tính khả dụng của thiết bị được cung cấp. Mặc dù mặt cắt đàn hồi lớn hơn ở điện áp thấp hơn, bộ lọc năng lượng trong cột hoặc sau cột có thể cải thiện thêm độ tương phản của hình ảnh bằng cách loại bỏ các electron phân tán không đàn hồi. Mặc dù hữu ích, việc sử dụng chúng dường như không phải là điều cần thiết để có được các bản dựng lại có độ phân giải cao. Các micelle chất tẩy rửa và hệ thống không có chất tẩy rửa, trong đó phần lớn là các đĩa nano lipid dựa trên protein khung màng (MSP) , cho thấy sự phân bố gần như bằng nhau giữa các cấu trúc protein màng ở 200 keV (Hình 1f). Một đặc điểm chung của hầu hết các bản tái tạo có độ phân giải dưới 3Å dường như là lớp hạt đơn lơ lửng trong lớp đông lạnh có độ dày phù hợp. Vì độ dày của băng ảnh hưởng đến độ tương phản của hình ảnh và tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu, việc xác định phạm vi độ dày băng phù hợp để tăng chất lượng hình ảnh là tối quan trọng, đặc biệt là đối với các protein màng nhỏ. Trong trường hợp của chất vận chuyển ECF, phạm vi độ dày lớp đông lạnh phù hợp với mật độ hạt cao đã được xác định như một phần của quy trình làm việc trước khi thu thập dữ liệu. Chiến lược này có thể được áp dụng để tối đa hóa chất lượng và hiệu quả của việc thu thập dữ liệu bất kể điện áp tăng tốc.

Một thách thức đang diễn ra nằm ở việc xác định cấu trúc của các protein màng nhỏ và/hoặc không đối xứng tương đối phong phú (< 150 kDa) được ngâm hoàn toàn vào màng và không có các đặc điểm ngoài màng. Mặc dù các hạt dễ dàng phân biệt được trong lớp đông lạnh, chúng thường bị lệch nghiêm trọng trong quá trình xử lý hình ảnh, do các micelle chất tẩy rửa không có cấu trúc hoặc các đĩa nano lipid xung quanh protein, thường có mặt cắt tán xạ electron tương tự hoặc mạnh hơn chính protein. Một chiến lược thành công để khắc phục vấn đề này trong cryo-EM là sử dụng chất kết dính kháng nguyên như Fab, nanobody, các thể đồng hợp tử, và các cấu trúc tăng cường tương ứng như các khối lớn, NabFabs và Legobodies, có thể đóng vai trò tiêu chuẩn trong quá trình xử lý hình ảnh.

Trong khi phần lớn các protein màng nhỏ đã được thu được trên TEM 300 kV , độ tương phản hình ảnh được tăng cường do hình ảnh ở 200 keV cung cấp có thể là một lợi thế và giúp ích trong quá trình căn chỉnh hình ảnh . Điều này được làm nổi bật bởi sự bùng nổ của các bản tái tạo dưới 150 kDa ở 200 keV chiếm khoảng 25% các mục trong hai năm qua. Sự tái tạo protein màng nhỏ nhất ở 200 keV là dạng đơn phân của Mouse Tweety Homolog 2 (∼59 kDa, độ phân giải 4 Å) (Bảng bổ sung 1). Đáng chú ý, trong cotransporter kali clorua 4 của chuột (∼120 kDa), chỉ một nửa protein được cấu trúc (∼58 kDa, độ phân giải 3,6 Å). Cả hai quá trình tái tạo đều được hưởng lợi từ sự hiện diện của một phần ngoài màng nhỏ nhưng có thể nhận biết được, đủ để tạo điều kiện cho sự sắp xếp các hạt đáng tin cậy và đại diện cho các quá trình tái tạo protein màng nhỏ nhất mà không có chất kết dính kháng nguyên cho đến nay. Các ví dụ ở 200 keV, nơi cần có chất kết dính kháng nguyên, là việc sử dụng Fab để tái tạo chất vận chuyển glutamate dạng túi 2 của chuột (∼65 + 45 kDa, độ phân giải 3,8 Å), chất vận chuyển serotonin của con người (∼75 + 45 kDa, độ phân giải 4,8 Å), và kháng nguyên tế bào lympho B của con người CD20 (∼33 kDa x 2 + ∼45 kDa x 2, độ phân giải 4,7 Å).

Triển vọng

Không thể phủ nhận, cryo-EM đã nổi lên như một công cụ mạnh mẽ để khám phá thuốc dựa trên cấu trúc trên nhiều mục tiêu protein màng bao gồm thụ thể, chất vận chuyển và kênh ion. Các bản dựng lại ở độ phân giải thấp đến trung bình (8–4 Å) đã đủ để lập bản đồ epitope của kháng thể, hình dung các cấu hình do phân tử nhỏ tạo ra và/hoặc xác định các vị trí liên kết phân tử nhỏ được cho là . Ngược lại, các bản đồ có độ phân giải cao hơn (4–2 Å) cho phép xác định chính xác cấu trúc protein, vị trí của các phân tử nhỏ, rotamer, ion và nước có cấu trúc.

Mặc dù không cung cấp thiết lập tốt nhất có thể, cryo-TEM 200 kV đã chứng minh là giải pháp thay thế đầy đủ cho kính hiển vi 300 kV cao cấp. Chúng phù hợp để có được các bản tái tạo độ phân giải cao của protein màng, từ 60 kDa đến 2,2 MDa và cung cấp những hiểu biết có giá trị về quá trình chuyển đổi cấu hình, biến dạng màng, và mật độ không phải protein như nước, lipid và các phân tử nhỏ. Trên thực tế, nhiều bản tái tạo cryo-EM của các mục tiêu có liên quan đến dược lý khi có mặt các phân tử nhỏ hoặc tác nhân điều trị , làm nổi bật tiềm năng sử dụng cryo-TEM 200 kV để hỗ trợ các nỗ lực khám phá thuốc dựa trên cấu trúc. Ví dụ là các nghiên cứu về cấu trúc của thụ thể liên kết protein G liên quan đến Mas X2 và X4 (độ phân giải 2,45–2,9 Å), thụ thể serotonin 5-HT3 (độ phân giải 2,8 Å)], thụ thể peptide giống glucacon-1 (độ phân giải 3,2 Å), chất vận chuyển axit amin trung tính ASCT2 (độ phân giải 3,4 Å), hoặc kháng nguyên tế bào lympho B CD20 (độ phân giải 4,7 Å) . Trong trường hợp thụ thể peptide-1 giống glucacon, việc so sánh các tái tạo ở 200 keV (độ phân giải 3,2 Å) và 300 keV (độ phân giải 2,8 Å) cho thấy mật độ của phân tử nhỏ và nước có trật tự hầu như giống hệt nhau. Cuối cùng, vì được sử dụng như kính hiển vi sàng lọc chuyên dụng nên các thiết bị 200 kV tiết kiệm hơn này thường có tính cục bộ và dễ tiếp cận hơn so với các thiết bị 300 kV tương tự, cung cấp phản hồi nhanh hơn về chất lượng mẫu và đầu ra.

Sự tập trung gần đây cho thấy cryo-TEM 100 kV có thể trở thành công cụ phù hợp cho các mẫu cryo-EM hạt đơn mỏng (<300 Å), cho thấy tiềm năng làm cho cryo-EM trở nên dễ tiếp cận hơn và có giá cả phải chăng hơn đối với cộng đồng khoa học rộng lớn hơn. Để đạt được điều này, cần có các máy dò phù hợp hơn cho TEM điện áp gia tốc thấp. Cryo-TEM cấp đầu vào “Tundra” (Thermo Fisher Scientific) là hệ thống cryo-TEM hoàn chỉnh đầu tiên có sẵn trên thị trường để chụp ảnh ở mức 100 keV và bao gồm các thành phần và đặc tính do các tác giả đề xuất. Đáng chú ý, thiết lập này đã được chứng minh là có khả năng đạt được độ phân giải dưới 3 Å, như được chứng minh bằng việc tái tạo apoferritin ở chuột (độ phân giải 2,6 Å). Hơn nữa, cấu trúc của thụ thể β3-GABAA người dạng homo-pentameric trong phức hợp với một megabody trong các đĩa lipid với độ phân giải 3,4 Å (EMD-13816) đã được xác định bằng thiết lập này (Hình 1b). Đây là cùng một loại protein đạt độ phân giải 1,7 Å với 300 kV, cho thấy cấu trúc có độ phân giải cao nhất của protein màng bằng cryo-EM cho đến nay. Các ví dụ được mô tả ở đây làm nổi bật tiềm năng của cryo-TEM ở mức điện áp tăng tốc thấp hơn – thường bị gọi thành “máy sàng lọc” —để xác định cấu trúc (ban đầu) thường quy của protein (màng) tại các cơ sở địa phương.

Nguồn: Thangaratnarajah, Chancievan, Jan Rheinberger, and Cristina Paulino. “Cryo-EM studies of membrane proteins at 200 keV.” Current Opinion in Structural Biology 76 (2022): 102440. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959440X22001191?via%3Dihub

Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các dòng Kính hiển vi điện tử truyền qua(TEM) hãng Thermo Fisher Scientific.