Kỹ thuật kính hiển vi điện tử truyền qua Cryo-electron (cryo-EM) là công cụ thiết yếu để xác định cấu trúc của protein và đại phân tử. Những tiến bộ công nghệ gần đây đã cải thiện thông lượng và độ phân giải, cách mạng hóa các ứng dụng tiềm năng của cryo-EM trong việc khám phá dược phẩm.
Thiết kế hợp lý các liệu pháp thế hệ tiếp theo được hưởng lợi rất nhiều từ việc quan sát trực tiếp ở độ phân giải cao các dược phẩm nhắm trúng đích liên kết với các chất ức chế phân tử nhỏ của chúng. Cách tiếp cận dựa trên cấu trúc này trong thiết kế dược phẩm có thể dẫn đến tính đặc hiệu cao hơn, tạo ra các loại thuốc hiệu quả hơn với ít tác dụng phụ hơn.
Với những tiến bộ không ngừng trong phần cứng và phần mềm, cryo-EM đã tiếp tục đẩy giới hạn của phân tích dựa trên cấu trúc cho các đại phân tử, đặc biệt là những phân tử khó kết tinh và đặc trưng hóa bằng các phương pháp cấu trúc truyền thống. Các kỹ thuật cryo-EM như phân tích hạt đơn (SPA) đã được điều chỉnh để phân tích cấu trúc của protein và phân tử nhỏ, cho phép hình dung các phức hợp dược phẩm nhắm trúng đích ở độ phân giải cao, cũng như các tương tác của các phân tử nhỏ hoặc các tập hợp đại phân tử lớn. Các cấu trúc phân tử được xác định bằng SPA cung cấp những phân tích ở cấp độ gần nguyên tử cho việc phát triển dược phẩm, hướng dẫn thiết kế hợp chất từ việc tìm ra hit đến lead và hơn thế nữa. Cryo-EM hạt đơn đặc biệt phù hợp để xác định cấu trúc sinh học và cung cấp thông tin quan trọng cho nhiều ứng dụng khám phá dược phẩm khác như lập bản đồ epitope kháng thể trị liệu và phân tích cấu trúc của các sản phẩm sinh học ngày càng lớn.
Cryo-EM đang đáp ứng áp lực ngày càng tăng để giảm thời gian ra thị trường cho các loại thuốc mới bằng cách cung cấp những hiểu biết mới về mối quan hệ cấu trúc-hoạt động. Điều này có thể giảm số lượng hợp chất cần phải tổng hợp và thử nghiệm, từ đó cho phép xác định các ứng viên dược phẩm hiệu quả cao trong ít lần lặp hơn.
Một trong những thách thức liên tục đối với các liệu pháp mới là tính đặc hiệu. Với việc đặc trưng hóa cấu trúc, khả năng chọn lọc của chất ức chế có thể được xác định thông qua thông tin độ phân giải cao từ các phức hợp protein-phân tử nhỏ. Điều này đòi hỏi phân tích với thông lượng cao các phức hợp nhỏ (<100 kDa) và thường không đối xứng. Trong ghi chú ứng dụng này, một phương pháp phân tích nhanh, độ phân giải cao của các phức hợp protein-dược phẩm được nêu bật, được phát triển bởi các nhà nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu Ung thư (Anh) hợp tác với các nhà khoa học tại Thermo Fisher Scientific. Thông qua việc sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua Thermo Scientific™ Glacios™ 2 Cryo-TEM mới nhất, họ đã có thể xác định hơn hai chục cấu trúc kinase 3,5–4,5 Å với tốc độ khoảng 1 cấu trúc mỗi giờ.
Phương pháp
Tổng thể, phương pháp bao gồm việc đặc trưng hóa lưới và xác định cấu trúc độ phân giải trung gian trên Cryo-TEM 200 kV, sau đó thu thập dữ liệu cao cấp trên Thermo Scientific™ Krios™ G4 Cryo-TEM 300 kV có độ phân giải cao hơn. Điều này cho phép các cấu trúc ban đầu được thu thập nhanh chóng trong khi xác định các mẫu lý tưởng cho việc thu thập dữ liệu chất lượng cao hơn. Các mẫu này nên có độ dày băng tốt, mật độ hạt và định hướng phù hợp, sự xuất hiện của chất ức chế, và độ phân giải cấu trúc ban đầu triển vọng dựa trên quá trình xử lý dữ liệu.
Hình 1. Quy trình làm việc được sử dụng để đánh giá các chất ức chế CDK.
Tối ưu hóa mẫu được thực hiện trên Glacios 2 Cryo-TEM 200 kV, được trang bị Bộ lọc Năng lượng Thermo Scientific™ Selectris™ X và Máy dò Thermo Scientific™ Falcon™ 4i. Việc xử lý mẫu và thu thập dữ liệu được kiểm soát bằng phần mềm Thermo Scientific EPU Multigrid. Dữ liệu được thu thập bằng cách sử dụng hình ảnh không có vân nhiễu (FFI) và dịch chuyển hình ảnh không quang sai (AFIS) với thông lượng ~500 hình ảnh/giờ.
Dữ liệu độ phân giải cao sau đó được thu thập trên Krios G4 Cryo-TEM 300 kV, cũng được trang bị Bộ lọc Năng lượng Selectris X và Máy dò Falcon 4i, cùng với súng phát xạ trường lạnh (cold-FEG). Cấu hình này cũng cung cấp thông lượng ~500 hình ảnh/giờ.
Kết quả và thảo luận
Cryo-EM độ phân giải cao của CAK ở người
Kinase hoạt hóa CDK (CAK) ở người là một phức hợp protein dị trùng hợp gồm kinase phụ thuộc cyclin 7 (CDK7), cyclin H và MAT1. CAK hoạt động như một bộ điều chỉnh chính của sự tăng trưởng và phân chia tế bào bằng cách điều chỉnh sự khởi đầu của phiên mã và chu kỳ tế bào. Do vai trò trung tâm của nó trong sinh lý tế bào, CAK là hợp chất tiềm năng cho liệu pháp ung thư và các loại thuốc kháng virus.
Một trong những thách thức chính trong việc phát triển các hợp chất ức chế CDK là tính đặc hiệu; có 20 isoform khác nhau được phân loại là CDK, và chúng thường có sự trùng lặp cao về trình tự gần các vị trí xúc tác của chúng. Việc giảm các hiệu ứng ngoài mục tiêu và tăng cường hiệu lực cho các liệu pháp mới sẽ đòi hỏi các phương pháp thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc.
14 hợp chất dẫn đầu đã được phân tích trong nghiên cứu này, nhưng phương pháp này có thể mở rộng cho các tập hợp lớn hơn của các phối tử phân tử nhỏ. Phần mềm EPU Multigrid đã được sử dụng cho cả quá trình sàng lọc ban đầu và thu thập dữ liệu. Được thiết kế cho các cryo-TEM có trang bị autoloader, phần mềm EPU Multigrid cho phép người dùng xếp nhiều lưới để sàng lọc và thu thập dữ liệu không cần giám sát. Tối đa 12 lưới có thể được chụp ảnh trong một phiên kính hiển vi. Chỉ cần 1 giờ thu thập dữ liệu cho mỗi tập dữ liệu để xác định 26 cấu trúc trên Glacios 2 Cryo-TEM, xác nhận sự hiện diện của 12 chất ức chế khác nhau từ 13 mẫu. Hầu hết các cấu trúc này được xác định ở độ phân giải ~3.5–4.5 Å.
Việc xác định cấu trúc độ phân giải trung gian cũng được hoàn thành bằng cách sử dụng Glacios 2 Cryo-TEM 200 kV. Thời gian thu thập dữ liệu được kéo dài đến 4 giờ mỗi mẫu, đạt được độ phân giải ~3 Å cho 12 tập dữ liệu. Ở độ phân giải này, các khác biệt cấu hình chính giữa các mẫu đã rõ ràng và các chất ức chế có thể được nhìn thấy trong mật độ cryo-EM.
Hình 2. Cấu trúc của CAK được giải quyết bằng Glacios 2 Cryo-TEM.
Hệ thống Glacios 2 Cryo-TEM tiên tiến đã làm cho phân tích chất lượng cao trở nên khả thi trên các thiết bị 200 kV. Tối ưu hóa phần cứng đã tập trung vào việc cải thiện tính đặc hiệu và độ nhạy trong phát hiện electron. Ví dụ, Máy dò Electron Trực tiếp Thermo Scientific™ Falcon™ 4i cho phép đạt được hiệu suất lượng tử phát hiện cao (DQE) trên toàn dải quang phổ, thu nhận cả protein nhỏ/mềm dẻo và các cấu trúc lớn hơn bằng ít hình ảnh hơn. Khi kết hợp với Bộ lọc Năng lượng Thermo Fisher Selectris™ hoặc Selectris X mới, tín hiệu được giới hạn ở các electron tán xạ đàn hồi không tổn thất, tạo ra dữ liệu TEM độ tương phản cao cho thông lượng cao hơn và cấu trúc có độ phân giải cao hơn.
Dữ liệu độ phân giải cao được thu thập trên Krios G4 Cryo-TEM 300 kV nhằm mô hình hóa chính xác các chất ức chế liên kết và xác định bất kỳ phân tử nước nào có thể góp phần vào việc liên kết và tính đặc hiệu của chất ức chế.
Trong nghiên cứu này, các cấu trúc của CAK được xác định ở độ phân giải lên đến 1.8 Å cho trạng thái tự do và trạng thái liên kết nucleotide của nó, cũng như trong phức hợp với 14 chất ức chế, với độ phân giải tốt nhất là 1.7 Å. Những cấu trúc này cung cấp cái nhìn chi tiết về các tương tác của chất ức chế cũng như mạng lưới các phân tử nước được tìm thấy trong vị trí hoạt động của CDK7.
Kết luận
Ghi chú ứng dụng này làm nổi bật quy trình sàng lọc cryo-EM ba bước và quy trình loại bỏ sớm cho việc khám phá dược phẩm dựa trên cấu trúc. Phương pháp này có thể giúp các nhà nghiên cứu hiểu cách các chất ức chế đa dạng về cấu trúc tương tác với vị trí hoạt động của CDK7, cung cấp cơ sở tiềm năng cho việc thiết kế các liệu pháp ung thư thế hệ tiếp theo.
Phương pháp này đặc biệt phù hợp cho việc khám phá dược phẩm, vì các cấu trúc có độ phân giải cao nhất không phải lúc nào cũng cần thiết để xác định các hợp chất dẫn đầu triển vọng. Bằng cách cung cấp thông tin cấu trúc chỉ trong vài giờ, Glacios 2 Cryo-TEM cho thấy giá trị của phương pháp này trong việc khám phá dược phẩm sớm. Khi các hợp chất đạt được nhiều lợi ích trong quy trình tối ưu hóa học, dữ liệu độ phân giải cao hơn trở nên có giá trị hơn, cung cấp những hiểu biết sâu sắc hơn có thể cải thiện thiết kế thuốc và giảm tác dụng phụ.
Như đã được trình bày trong nghiên cứu này, cryo-EM hiện có thể thu thập dữ liệu để xác định cấu trúc khoảng 2 Å của các phức hợp protein nhỏ trong vòng chưa đầy một ngày. Điều này cho phép cryo-EM có thông lượng cao và độ phân giải cao. Ngoài ra, hơn một chục cấu trúc có thể được sàng lọc ở độ phân giải ~3.5–4.5 Å trong một ngày.
Tóm lại, Glacios 2 Cryo-TEM đóng vai trò như một hệ thống sàng lọc mạnh mẽ, tăng cường phân tích 300 kV tiếp theo. Cách tiếp cận này cải thiện đáng kể thông lượng và năng suất, tối ưu hóa thời gian sử dụng Krios Cryo-TEM độ phân giải cao và đảm bảo rằng dữ liệu chất lượng cao nhất được thu thập chỉ cho các mẫu lý tưởng nhất. Phương pháp này tạo điều kiện thuận lợi cho việc áp dụng cryo-EM vào thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc lặp lại, điều này ngày càng cần thiết để giải quyết một loạt các thách thức về sức khỏe toàn cầu.