Tóm tắt
Kính hiển vi điện tử cryo (cryo-EM) đã cách mạng hóa việc khám phá thuốc dựa trên cấu trúc bằng cách cho phép hình dung chính xác và nhanh chóng các tương tác thuốc nhắm mục tiêu ở độ phân giải cao. Trong nghiên cứu này, Thermo Fisher trình bày quy trình làm việc sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua cryo (cryo-TEM) Thermo Scientific Glacios 200 kV được trang bị bộ lọc hình ảnh Thermo Scientific Selectris X và máy dò Thermo Scientific Falcon 4i để sàng lọc thông lượng cao liên kết thuốc trên phức hợp CDK-Activating Kinase (CAK). Chỉ với một giờ thu thập dữ liệu, Thermo Fisher đã thu được các cấu trúc ở 4 Å, đủ để xác định túi liên kết hợp chất chì và mật độ. Với bốn giờ thu thập dữ liệu, các cấu trúc tiến gần đến 3 Å, cho phép hình dung cấu hình hợp chất chì. Các lưới tốt nhất được chụp bằng kính hiển vi điện tử cryo Thermo Scientific Krios 300 kV đã phân giải cấu trúc thành 2 Å, cho phép mô hình hóa các vùng nước có trật tự để cung cấp thông tin cho quá trình tối ưu hóa hợp chất chì. Nghiên cứu của Thermo Fisher chứng minh rằng cryo-TEM 200 kV có thể mang lại năng suất cao cần thiết cho việc thiết kế và khám phá thuốc dựa trên cấu trúc, trong khi hình ảnh mục tiêu trên cryo-TEM 300 kV có thể cung cấp độ phân giải thậm chí còn cao hơn.
Tiêu chuẩn apoferritin
Để kiểm tra giới hạn của Glacios Cryo-TEM 200 kV với Thermo Scientific Selectris X và Falcon 4i, chúng tôi đã mặc định sử dụng tiêu chuẩn apoferritin. Kết quả đạt được 1,6 Å (Hình 1) với ~7 giờ thu thập dữ liệu ở ~650 hình ảnh/giờ, điều này khuyến khích việc xem xét phức hợp CDK-Activating Kinase khó khăn hơn.
Hình 1. Tái tạo Cryo-EM của apoferritin ở 1,6 Å. Bảng bên trái hiển thị bản đồ mật độ cryo-EM; bên phải – mật độ được phóng to với tọa độ mô hình nguyên tử apoferritin.
kinase hoạt hóa CDK
Phức hợp kinase hoạt hóa CDK (CAK) ở người là một mục tiêu thú vị cho các loại thuốc điều trị ung thư do nó tham gia vào quá trình kiểm soát khởi đầu phiên mã và chu kỳ tế bào. Để có thể khám phá và thiết kế hợp lý các liệu pháp thế hệ tiếp theo với hiệu lực tăng lên và giảm các tác dụng ngoài mục tiêu, dữ liệu cấu trúc cho phép áp dụng các phương pháp thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc là công cụ. Do đó, Thermo Fisher bắt đầu mô tả cấu trúc các phức hợp CAK liên kết với một loạt các phân tử có sẵn trên thị trường và một loạt các hợp chất được phát triển và mô tả cùng với ICEC09423 , nhằm mục đích khám phá cơ sở cấu trúc của tính chọn lọc chất ức chế CDK7 để mở đường cho các liệu pháp thế hệ tiếp theo.
Sàng lọc hợp chất CAK
Trong quy trình sàng lọc thông lượng cao, nhiều phức hợp CAK với các phối tử phân tử nhỏ khác nhau được chụp ảnh trong 1 giờ ban đầu (Hình 2), sau đó các mẫu có triển vọng được chụp ảnh trong 4 giờ. Trong giờ chụp ảnh đầu tiên, độ phân giải đạt được là 3,5 – 4,5 Å, đủ để xác định các lưới có vấn đề về định hướng ưu tiên và/hoặc có mật độ hợp chất.
Hình 2. Xử lý trực tiếp các tập dữ liệu Glacios trong 1 giờ. Các bảng trên cùng hiển thị chế độ xem tái tạo 3D với CDK7 màu xám, cyclin màu nâu và MAT1 màu cam. Ngoài ra, chế độ xem cận cảnh về mật độ của chất ức chế liên kết được hiển thị màu tím. Các bảng ở giữa minh họa độ phân giải (FSC = 0,143). Cuối cùng, các bảng dưới cùng hiển thị các biểu đồ phân phối định hướng thu được từ cryoSPARC.
Cấu trúc độ phân giải cao của phức hợp CAK:ligand
Nhằm mục đích phân giải các chất ức chế liên kết CAK ở độ phân giải cao để cung cấp các mô hình phân tử có độ chính xác cao và xác định các phân tử nước có thể góp phần vào sự liên kết và tính đặc hiệu của chất ức chế, Thermo Fisher đã sử dụng Krios G4 300 kV để thu thập dữ liệu có độ phân giải cao. Việc thu thập dữ liệu kéo dài khoảng 10 giờ và tạo ra khoảng 5.000 ảnh chụp vi mô cho mỗi mẫu.
Quy trình sàng lọc và thu thập thông lượng cao của chúng tôi cho phép chúng tôi hình dung 12 phức hợp ức chế CAK ở độ phân giải 1,8-2,2 Å và hiểu rõ hơn về tính chọn lọc của chất ức chế (Hình 3)
Hình 3. Đặc điểm cấu trúc Cryo-EM của phức hợp CAK:Ligand. Phía trên bên trái – sơ đồ phức hợp CAK của con người và tái tạo 2,3 Å từ dữ liệu Glacios 2. Phía trên bên phải – mật độ cryo-EM phóng to chất lượng cao ở độ phân giải 1,9 Å từ dữ liệu Krios. Phía dưới (al) – cấu trúc của chất ức chế liên kết với CDK7.
Kết luận
Nghiên cứu này báo cáo việc xác định cấu trúc cryo-EM của nhiều phức hợp CAK với các phối tử phân tử nhỏ khác nhau, đây là bước tiến đáng kể trong việc thiết kế chất ức chế CDK7. Kết quả của Thermo Fisher chứng minh tiềm năng của cryo-EM trong việc khám phá thuốc dựa trên cấu trúc và làm nổi bật năng suất của cả cryo-TEM 200 kV và 300 kV.
Glacios 2 200 kV, được trang bị bộ lọc năng lượng Selectris X, là một công cụ đa năng có thể cung cấp dữ liệu cryo-EM chất lượng cao cho các nghiên cứu có độ phân giải cao. Nó cũng có thể hoạt động như một công cụ sàng lọc thông lượng cao để chuẩn bị lưới cho việc sử dụng tiếp theo với Krios 300 kV, cho phép chụp ảnh có độ phân giải cao hơn nữa.
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các thiết bị Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) hãng Thermo Fisher.
EN