Giới thiệu
Giám sát môi trường (EM) là biện pháp kiểm soát vi sinh chính được ứng dụng trong ngành thực phẩm, đảm bảo tính an toàn và hiệu quả cho các sản phẩm dược.
Để kiểm soát hiệu quả chất lược của các sản phẩm này, các nhà sản xuất dược phẩm phải theo dõi các vi sinh vật gây ô nhiễm tiềm năng. Đây là ứng dụng điển hình. Điều này thường được thực hiện bằng cách sử dụng môi trường nuôi cấy của đĩa Petri trong suốt quá trình sản xuất, đặc biệt là trong các phòng sạch, buồng cách ly và môi trường sản xuất được kiểm soát.
Thực hành được chấp nhận rộng rãi để kiểm tra đĩa Petri bao gồm việc liệt kê các đơn vị hình thành khuẩn lạc vi khuẩn riêng biệt (CFU) trên mỗi đĩa sau khi đĩa đã được ủ theo các thông số về thời gian và nhiệt độ do người dùng cuối xác nhận. Tuy nhiên, thách thức nhân đôi là việc giám sát môi trường dược phẩm tạo ra hàng nghìn đĩa Petri mỗi tháng và không phải tất cả các vi sinh vật, vốn có thể hiếm gặp trong phòng sạch, đều phát triển thành các khuẩn lạc vĩ mô riêng biệt, do đó làm tăng nguy cơ bỏ sót chúng.
Phương pháp hiện tại cực kỳ thủ công và dễ xảy ra lỗi, nhưng vẫn là quy trình tiêu chuẩn được sử dụng cho hàng trăm triệu mẫu mỗi năm. Khi quá nhiều đĩa được đánh giá thủ công, QC dược phẩm dễ bị lỗi toàn vẹn dữ liệu, liệt kê không chính xác và bỏ sót mẫu. Kết quả ròng là tác động tiêu cực đến sự an toàn của bệnh nhân do các kiểm tra tốn thời gian và chi phí.
Do đó, tầm quan trọng của việc đếm chính xác các vi sinh vật đã được các cơ quan quản lý toàn cầu nhấn mạnh.
Trong bài viết này, Biomérieux đã đánh giá hiệu suất của việc kiểm tra đĩa Petri trực quan trong môi trường dược phẩm và giới thiệu một phương pháp chuẩn hóa mới để tự động hóa quá trình ủ và đếm các đĩa Petri bằng cách sử dụng hệ thống 3P® STATION. Kết quả được so sánh với các kết quả được tạo ra theo Quy trình vận hành tiêu chuẩn EM thông thường tại bốn công ty dược phẩm toàn cầu.
3P STATION giúp tự động hóa quá trình ủ và đếm các khuẩn lạc vi sinh vật trên các đĩa Petri EM theo thời gian thực. Hệ thống cải tiến này tự động hóa quá trình ủ các đĩa ở nhiệt độ từ 20°C đến 35°C, trong đó các thuật toán hiệu suất cao phát hiện và theo dõi sự phát triển của các vi sinh vật
Sử dụng camera có độ phân giải cao kết hợp với ống kính quang học telecentric tiên tiến, 3P STATION chụp ảnh độ nét cao mỗi giờ và tạo ra một thước phim để theo dõi sự phát triển của vi sinh vật. Trong nghiên cứu này, các đĩa nuôi cấy được ủ trong 3P STATION để tạo ra hình ảnh của vi sinh vật trong suốt quá trình ủ từ đầu đến cuối. Trong trường hợp các khuẩn lạc có thể gây khó khăn cho việc đếm, hệ thống cho phép người dùng tua lại thước phim phát triển đến đúng thời điểm có thể đếm được.
Phương pháp chuẩn hóa để kiểm tra đĩa giám sát môi trường
Vi sinh vật và điều kiện nhiệt độ
Năm chủng Dược điển được khuyến nghị (Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404) và các vi sinh vật tự nhiên in-house (2 vi khuẩn và 1 nấm mốc) gây ảnh hưởng trong quá trình đánh giá và đọc đĩa. Ba mức độ cấy được đánh giá: 5 CFU, 25 CFU and 50 CFU trên mỗi đĩa, năm bản sao được thực hiện trên mỗi kích cỡ nuôi cấy. Tất cả các vi sinh vật đều được nuôi cấy trên bioMérieux TSA 3P với Neutralizers ref. 43819 và Count-Tact 3P ref. 43699 ở nhiệt độ và thời gian ủ thích hợp để việc đọc đĩa dễ dàng hơn cho người vận hành.
3P STATION
Giới thiệu về phương pháp tham chiếu
Theo truyền thống, các nhà vận hành cá nhân có xu hướng đếm số lượng vi sinh vật khác nhau trên cùng một đĩa do cách diễn giải thủ công và tính không thể đoán trước của hình thái vi sinh vật (hình dạng, cụm, v.v.) và giới hạn phát hiện tự nhiên của mắt người.
Cần phải xác định số lượng CFU chuẩn hóa để đánh giá hiệu suất của phương pháp hiện tại. Để có được tiêu chuẩn này, Biomérieux đã phát triển một phương pháp để hiệu chỉnh số lượng thực tế của người vận hành bằng dữ liệu do tất cả các hình ảnh chụp từ đầu quá trình ủ tạo ra. Biomérieux định nghĩa nó là “Số đếm truyền thống tham chiếu”. Sau khi ủ trong 3P STATION, mỗi đĩa được một số người vận hành đếm độc lập, theo phương pháp đếm truyền thống. Các người vận hành không bị ảnh hưởng bởi dữ liệu của 3P STATION (hình ảnh hoặc số lượng). Mỗi nhà điều hành ghi lại số lượng trên giấy.
Trong bước thứ hai, sau khi đĩa được đọc bằng phương pháp truyền thống, đĩa vật lý được phân tích lần thứ hai bởi cùng một nhà điều hành cùng với sự hỗ trợ của 3P STATION. Bằng cách phát lại video và phóng to các khu vực cụ thể của đĩa, người vận hành có thể trực tiếp đánh dấu các khuẩn lạc trên hình ảnh cuối cùng của đĩa và đưa ra số đếm đã hiệu chỉnh—Số đếm truyền thống tham chiếu.
Số đếm này nhằm mục đích đại diện cho phép đếm theo tiêu chuẩn, gần nhất với thực tế.
Kết quả và thảo luận
Ba người vận hành khác nhau từ bốn công ty dược phẩm đã thực hiện đếm từng đĩa và cũng tạo ra Số đếm truyền thống tham chiếu.
Hình 1 cho thấy phân tích thống kê về phương sai được tính toán từ các phép đếm khác nhau theo từng loại chủng. Dữ liệu này cho phép Biomérieux đo lường mức độ lan truyền của tập hợp các phép đo so với Số đếm truyền thống tham chiếu. Phương sai càng cao thì độ chính xác của phép đọc càng thấp. Những kết quả này đã làm nổi bật ba thông số chính có thể ảnh hưởng đến hiệu suất đếm là:
Định dạng đĩa: Đĩa Count-Tact có bề mặt nhỏ hơn (đường kính của đĩa thạch tiếp xúc 55 mm thấp hơn so với đĩa thạch tiêu chuẩn 90 mm) tập trung các vi sinh vật gần nhau hơn và khó phát hiện hơn. Đây có vẻ là yếu tố chính ảnh hưởng đến chất lượng đếm: phương sai Count-Tact ∊[0; 23.57] > phương sai monoplate ∊[0; 7.82].
Kích thước nuôi cấy: độ chính xác của phép đếm giảm dần khi kích thước nuôi cấy tăng. Kết quả đếm tốt nhất thu được với chủng 5 CFU (phương sai ∊[0; 1,33]) và kém nhất với chủng 50 CFU (phương sai ∊[0,77; 23,57]), 25 CFU xác nhận kết quả trung gian.
Hình thái của vi sinh vật: các chủng có hình dạng không được xác định rõ (viền mờ hoặc không đều, trong mờ, v.v.) khó đếm chính xác hơn.
Khi xem xét các vi sinh vật tự nhiên đã thử nghiệm, nấm mốc (chủng hoang dã 3) có vẻ là vi sinh vật khó đếm chính xác nhất và điều này được nhấn mạnh bởi loại đĩa và kích thước chủng. Các thông số khác nhau được mô tả ở trên tác động đến khả năng phân biệt các khuẩn lạc.
Để đánh giá tác động của hình thái khuẩn lạc đến độ chính xác của quá trình đếm, đã tiến hành phân tích chủng 25 CFU. Kết quả được trình bày trong Hình 2 với sự khác biệt về số lượng quan sát được giữa mỗi người vận hành và Số đếm truyền thống tham chiếu.
Hình 2 xác định rằng loại đĩa Petri ảnh hưởng đến khả năng phát hiện vi sinh vật trên thạch. Độ lệch chuẩn cao hơn trên các đĩa Count-Tact, tuy nhiên, có thể quan sát thấy các giá trị ngoại lai trên định dạng đĩa 90 mm, đặc biệt là trên chủng B. subtilis, nơi quan sát thấy các phép đếm bị đánh giá thấp. Tác động của hình thái trong việc đếm chính xác dễ thấy hơn trên định dạng Count-Tact – các khuẩn lạc không có hình dạng rõ ràng (A. brasiliensis) hoặc trong mờ (P. aeruginosa) cho kết quả kém chính xác hơn. Một phân tích khác có thể được thực hiện bằng cách xem xét sự phân bố của các phép đếm mà người vận hành quan sát được và sự khác biệt về mặt phát hiện sai so với Đếm tham chiếu truyền thống, như được nêu bật trong Hình 3
Phần bên trái của biểu đồ hiển thị số lần đếm của người vận hành với các khuẩn lạc bị bỏ sót (từ 1 đến 6) và phần bên phải của biểu đồ hiển thị số lần đếm của người vận hành với các khuẩn lạc bổ sung bị đếm sai (từ 1 đến 5). Hình này chứng minh rằng số lượng khuẩn lạc bị bỏ sót cao hơn số lượng khuẩn lạc được thêm vào do nhầm lẫn. Hy vọng rằng phần lớn các lần đếm đều bằng với Số đếm tham chiếu truyền thống và sự khác biệt chỉ là do chênh lệch 1 CFU. Có thể xảy ra sự chênh lệch cao hơn 2 CFU nhưng ít xảy ra hơn.
Tác động của hình thái có thể dễ dàng thấy được khi xem xét số lần đếm chính xác (chênh lệch giữa số lần đếm của người vận hành và Số lượng tham chiếu truyền thống = 0). Các vi sinh vật có hình dạng được xác định rõ nhất (S. aureus và C. albicans) được đếm chính xác hơn. Các vi khuẩn có hình dạng khó hơn (B. subtilis và P. aeruginosa) được đếm ít hơn một chút. Cuối cùng, nấm mốc (A. brasiliensis) kém xa các loại khác về phương diện đếm chính xác.
Bảng 1 cho thấy tổng quan về hiệu suất đếm của mỗi người vận hành trên tất cả các khuẩn lạc được thấy trên các đĩa khác nhau. Tỷ lệ Dương tính Giả thấp hơn tỷ lệ Âm tính Giả. Tỷ lệ Âm tính Giả có thể thay đổi từ 1,26% đến 6,08%. Đây là kết quả đáng ngạc nhiên đặt ra câu hỏi về độ tin cậy của phương pháp kiểm tra đĩa truyền thống
Kết luận
Nghiên cứu này trình bày một phương pháp mới dựa trên Số đếm truyền thống tham chiếu được tạo ra từ 3P STATION. Với cách tiếp cận này, sự thay đổi đó hiện đã được định tính tốt hơn. Việc đếm các đĩa Petri có thể khó khăn do hình thái, kích thước và sự tập trung của các vi sinh vật, dẫn đến sự thay đổi kết quả tăng lên và chủ yếu dẫn đến việc ước tính thấp số lượng thực tế của các vi sinh vật trên một đĩa. Một cải tiến đơn giản có thể là đọc tự động để cung cấp một phương pháp đếm mạnh mẽ và chuẩn hóa. Ngành dược phẩm nên cân nhắc thay thế phương pháp đếm đĩa truyền thống bằng các máy ủ tự động và máy đọc đĩa. Ngoài tính nhất quán trong kết quả, công nghệ này sẽ cải thiện tính toàn vẹn của dữ liệu, dẫn đến phân tích xu hướng mạnh mẽ hơn và cuối cùng sẽ cảnh báo sớm hơn khi một mẫu vượt quá thông số kỹ thuật của nó, do đó cho phép đưa ra quyết định nhanh hơn.
Công ty Minh Khang là nhà phân phối độc quyền giải pháp Giám sát môi trường hãng bioMérieux (Pháp).
EN