Tóm tắt
Chương <1116> của USP mô tả Giám sát Môi trường (EM) là một yếu tố quan trọng để đảm bảo rằng một khu vực xử lý không trùng hợp được duy trì ở mức độ kiểm soát đủ. Chất lượng của các loại thuốc được sản xuất liên quan trực tiếp đến khả năng duy trì mức độ ô nhiễm vi khuẩn rất thấp. Kỹ thuật duy nhất để hiểu và theo dõi sự tiến triển của sự ô nhiễm trong các phòng sạch quan trọng này là sử dụng các loại môi trường nuôi cấy cụ thể có thể phục hồi hệ vi sinh vật môi trường. Thông thường, đĩa Petri được sử dụng để kiểm soát không khí và bề mặt và nuôi cấy vi khuẩn tiềm năng được tìm thấy trong các khu vực phân loại. Thực hành chấp nhận được cho việc kiểm tra đĩa bao gồm, sau khi ủ phù hợp (nhiệt độ và thời gian), đếm các đơn vị hình thành tảo (CFU) rời rạc. Các vi khuẩn sau đó sẽ phát triển thành các tảo hiển vi rõ ràng. Quy mô này mô tả những thứ mà một người có thể thấy trực tiếp, mà không cần sự hỗ trợ của các thiết bị phóng đại. Điều này có nghĩa là những người vận hành trực tiếp quan sát các đĩa Petri nên phân biệt được sự hiện diện của các vi sinh vật bằng mắt thường. Nhưng điều gì là giới hạn xác định một đối tượng rõ ràng? Và ở mức độ kích thước nào có thể coi là phát hiện chính xác? Để trả lời những câu hỏi đó, một phương pháp tiêu chuẩn để đánh giá hiệu suất của việc đọc thủ công được trình bày trong nghiên cứu này.
Giới thiệu
Giám sát Môi trường (EM) là một trong những biện pháp kiểm soát vi khuẩn chính mà các ngành công nghệ sinh học và dược phẩm thực hiện. Điều này đảm bảo an toàn và hiệu quả của các sản phẩm dược phẩm và là một biện pháp kiểm soát quan trọng cần xem xét khi các công ty phát hành các sản phẩm dược phẩm của họ ra thị trường. Phương pháp này dễ gặp lỗi, nhưng nó vẫn là quy trình tiêu chuẩn được sử dụng trong ngành công nghiệp cho hàng trăm triệu mẫu mỗi năm. Thực tế, phân tích xu hướng giám sát môi trường dựa vào độ chính xác của các kết quả thu được trên tất cả các đĩa Petri được sử dụng trong các môi trường sản xuất quan trọng. Phân tích là phương pháp định lượng, các kết quả được biểu diễn dưới dạng số lượng CFU. Việc kiểm tra hình ảnh của các phương tiện nuôi cấy rắn này được thực hiện bởi các người vận hành đủ điều kiện phải tuân thủ các phương pháp thí nghiệm vi sinh học tốt nhất được mô tả trong chương <1117> của USP. Ngoài chuyên môn vững, một quá trình đào tạo nội bộ cũng phải được thực hiện để đảm bảo kết quả chính xác và có thể lặp lại được. Dựa trên lý thuyết, không có lý do gì để có sự không nhất quán trong kết quả giữa các người vận hành được đào tạo khác nhau. Việc đạt được kết quả tiêu chuẩn là khó khăn do sự biến động tự nhiên của con người trong việc nhìn và đánh giá. Sự đa dạng lớn về hình thái của vi khuẩn có thể làm cho việc phát hiện chính xác khó khăn và việc cung cấp một phép đếm chính xác, trong một số trường hợp, có thể là một thách thức thực sự. Điều này được minh họa bằng nhiều biểu mẫu FDA 483 (12) được phát hành từ năm 2011 đến 2021 do các hành vi tác động trong quá trình kiểm tra đĩa Petri. Một nửa trong số đó có thể được quy cho các lỗi đếm! Điều này đặt ra câu hỏi về độ chính xác của các kết quả được tạo ra trong quá trình kiểm tra hình ảnh của các đĩa Petri. Vì lý do này, bioMérieux đã phát triển một phương pháp cụ thể để tiêu chuẩn hóa và đo lường chất lượng phát hiện bao gồm các sự kiện khó khăn trên phương tiện nuôi cấy dành cho EM.
Các phương pháp giám sát môi trường (EM)
Các hạt được hiệu chuẩn
Hạt nhựa Polyethylene màu đen, Cospheric LLC (53-63µm, mã tham chiếu BKPMS-1.2 53-63um-10g ; 90-106µm, mã tham chiếu BKPMS-1.2 90-106um-10g ; 212-250µm, mã tham chiếu BKPMS-1.2 212-250um-10g ; 425-500µm, mã tham chiếu BKPMS-1.2 425-500um-10g)
Hạt nhựa Polyethylene trong suốt, Cospheric LLC (53-63µm, mã tham chiếu CPMS-1.2 53-63um-10g ; 90-106µm, mã tham chiếu CPMS-1.2 90-106um-10g ; 212-250µm, mã tham chiếu CPMS-1.2 212-250um-10g ; 425-500µm, mã tham chiếu CPMS-1.2 425-500um-10g) • Đĩa Petri và môi trường nuôi cấy Một môi trường cụ thể không có hiệu suất phát triển đã được đổ vào đĩa Petri LockSure® (định dạng sở hữu của bioMérieux) dành cho kiểm soát môi trường. Công thức đã được thiết lập để ngăn sự phát triển của vi sinh vật trên bề mặt và sau đó cho phép nhiều người đọc với cùng chất lượng và giới hạn sự xuất hiện của sự giao cắt ô nhiễm.
Công thức:
Agar______________________ 15g/L
Peptone_____________________________ 14g/L
NaCl________________________________ 60g/L
Vancomycin__________________________ 0.1g/L
Amphotericin B_______________________ 0.1g/L
Các đĩa Petri được đổ với một lượng 30mL. Hình ảnh cuối cùng của các đĩa giống như một môi trường nuôi cấy giám sát môi trường thông thường.
Chuẩn bị mẫu
Các hạt khác nhau được trực tiếp rải lên các đĩa agar. Kích thước hạt 425-450µm cho phép xử lý trực tiếp bằng kẹp. Đối với các kích thước khác, trước tiên, các hạt được đưa vào dung dịch muối sinh học và được pha loãng qua một chuỗi các bước pha loãng tuần tự để đạt được số hạt mong muốn trong 50µl dung dịch. Việc áp dụng lên agar được thực hiện với sự giúp đỡ của một máy ảnh cảm biến hình ảnh CMOS (Genie Nano XL® C5100 Color, mã tham chiếu G3-GC30-C5105 – Teledyne Dasla) đặt trên một bàn đèn chiếu sáng được dành riêng
Phương pháp luận
Một thiết kế thí nghiệm đã được thực hiện để trộn các thông số sau:
Tổng cộng có 1.088 đĩa chuẩn bị. 79% trong số chúng là âm tính và 21% được tiêm phóng với mục đích mô phỏng tỷ lệ cao hơn của các đĩa âm tính quan sát được trong các khu vực phòng sạch cấp độ cao.
12 người vận hành từ 3 phòng thí nghiệm đọc mỗi đĩa một cách độc lập: 2 phòng thí nghiệm từ bioMérieux (nghiên cứu và phương pháp kiểm tra chất lượng sản phẩm) và 1 phòng thí nghiệm phụ thuộc vào hợp đồng với công ty dược phẩm. Tất cả các người vận hành đã được đào tạo trước đó để đếm các đĩa Petri bằng cách sử dụng hạt thay vì vi sinh vật. Quá trình đếm được phân phối trong khoảng thời gian 5 ngày để giới hạn ảnh hưởng tiềm ẩn của mệt mỏi đối với chất lượng của kết quả. Việc kiểm tra các đĩa được thực hiện trong điều kiện thường xuyên đã được xác nhận với khả năng sử dụng nền đen và trắng cũng như ánh sáng bổ sung. Không cho phép sử dụng công cụ phóng đại.
Tổng cộng có 13.056 kết quả (10.296 trên các đĩa âm tính và 2.760 trên các đĩa dương tính) được tạo ra. Đối với các kết quả dương tính, tổng số dữ liệu cho mỗi tham số được giải thích dưới đây:
Việc tạo ra các mẫu chính xác với hạt màu trắng có kích thước 53-63µm đã không thể thực hiện được, ngay cả khi sử dụng máy ảnh phóng đại cao. Kích thước và độ tương phản cụ thể của hạt này không được phân tích trong nghiên cứu này.
Phân tích được thực hiện bằng cách sử dụng các phần mềm sau: SAS Entreprise Guide v7.1 và Rstudio V1.1.442.
Kết quả và thảo luận
Phân tích theo cấp độ đĩa
Mục tiêu của phân tích này là đánh giá sự nhận thức tự nhiên của các người vận hành trong quá trình kiểm tra hình ảnh và khả năng phân biệt kết quả dương tính từ kết quả âm tính. Trong phần này, chỉ hiệu suất phát hiện của các đĩa dương tính (có hạt) so với các đĩa âm tính được đánh giá, mà không xem xét đến độ chính xác của việc đếm. Kết quả được biểu diễn như sau:
Hiệu suất phát hiện của mỗi người vận hành được trình bày trong hình 3 và 4.
Hình 3 và 4 cho thấy sự biến động lớn trong kết quả giữa các người vận hành khác nhau. Điều này cho thấy có một mức độ lớn về tính chủ quan liên quan đến cách mà một đĩa được coi là dương tính hoặc âm tính bởi một người vận hành. Tiếp tục phân tích, chúng ta có thể phân loại các nhà điều hành thành 3 loại:
- Các người vận hành tạo ra rất ít kết quả giả âm tính nhưng ngược lại tạo ra rất nhiều kết quả giả dương tính (Người vận hành 2).
- Các người vận hành tạo ra rất nhiều kết quả giả âm tính nhưng rất ít kết quả giả dương tính (Người vận hành 3 hoặc 8).
- Các người vận hành tạo ra tỷ lệ kết quả giả âm tính và giả dương tính gần như như nhau (Người vận hành 6 hoặc 7).
Một giải thích có thể cho các kết quả này là sự khó khăn cho mắt người trong việc phân biệt các vật nhỏ cũng như tính chủ quan trong việc đánh giá chúng là có ý nghĩa hay không. Tất cả các hạt đã được phân bố bằng nhau hoặc dưới kích thước 500µm, có thể được coi là các vật thể rất nhỏ so với các khu vực vi khuẩn có thể đo đạc trong vài milimét. Trong những điều kiện như vậy, kiểm tra hình ảnh trên phương tiện rắn có thể bị ảnh hưởng bởi tiếng ồn nền. Microbubbles, hạt, tạp chất là một phần của phương tiện hoặc đã được thêm vào trong quá trình lấy mẫu có thể tạo ra sự nhầm lẫn giữa các hạt thực tế và các hạt khác (như bụi).
Bảng 1 rõ ràng cho thấy khi các đối tượng nhỏ, tất cả các sự kiện can thiệp có thể dẫn đến một sự hiểu sai. Lên đến 15 đối tượng đã được phát hiện bởi nhà điều hành 6 trên một đĩa âm tính! Ngay cả các nhà điều hành từ dân số 2 cũng có thể phát hiện một số lượng lớn các kết quả giả dương tính.
Phân tích tác động của các thông số khác nhau
Phần này của phân tích chỉ tập trung vào các đĩa dương tính và đánh giá sự chính xác của việc đếm được cung cấp bởi các nhà điều hành khác nhau. Kết quả của 12 nhà điều hành đã được kết hợp với nhau để đánh giá các tham số ảnh hưởng tổng thể đến kiểm tra hình ảnh.
Hình 5 cho thấy một sự tương quan rõ ràng giữa kích thước của hạt và hiệu suất phát hiện. Kích thước dường như là yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất. Đối với kích thước dưới 212-250µm, có sự giảm đáng kể trong phần trăm kết quả chính xác: từ khoảng 90% xuống dưới 70%. Sự phát triển tiêu cực này tăng lên với việc giảm kích thước của các hạt.
Yếu tố thứ hai ảnh hưởng đến độ chính xác của việc phát hiện là vị trí của đối tượng trên bề mặt. Điều này dễ nhìn thấy đối với các hạt có kích thước từ 212-250µm với độ tương phản yếu, phụ thuộc vào vị trí (ở giữa hoặc ở rìa), chúng ta quan sát thấy sự giảm đáng kể của phần trăm kết quả chính xác (lần lượt từ 91,20% xuống 64,80%). Ảnh hưởng của vị trí cũng xảy ra (với một ảnh hưởng ít hơn) đối với các hạt có kích thước từ 425-500µm với độ tương phản yếu, với sự giảm phần trăm kết quả tốt từ 99,40% cho các hạt ở giữa xuống 88,30% cho các hạt ở rìa.
Cuối cùng, yếu tố cuối cùng ảnh hưởng đến việc phát hiện là độ tương phản. Ảnh hưởng của độ tương phản ít đáng kể hơn hai yếu tố trước đó nhưng vẫn có mặt cho các hạt có kích thước từ 425-500µm với độ tương phản yếu. Ảnh hưởng của độ tương phản đối với việc phát hiện có thể dễ nhận thấy hơn đối với các hạt có kích thước xung quanh 212-250µm. Dường như hợp lý khi tương phản càng tốt, việc phát hiện càng dễ dàng
Kết luận
Trong năm 2011, Sutton đã xuất bản một bài báo về độ chính xác của việc đếm đĩa thể hiện sự biến đổi của các người vận hành và rằng vi sinh học chính nó là một giới hạn thực sự trong việc tạo ra dữ liệu đáng tin cậy. Trong bài báo này, mối tương quan giữa tỷ lệ lỗi ước lượng và tỷ lệ đếm đĩa thấp quan sát được minh họa rõ ràng. Dữ liệu của nghiên cứu của bioMérieux đã xác nhận sự biến động tự nhiên của các người vận hành có kỹ năng đang thực hiện kiểm tra hình ảnh của các đĩa Petri dành cho giám sát môi trường. Trong trường hợp của những phát hiện khó khăn, có một phần của tính chủ quan trong việc phân biệt các đối tượng nhỏ. Chúng ta có thể hiểu được ảnh hưởng của mức độ nhiễu nền đối với chất lượng của việc phát hiện. Tùy thuộc vào cách các người vận hành xác định các đối tượng là có liên quan hoặc không, sự cân bằng giữa dương tính giả và âm tính giả có thể khác biệt một cách đột ngột. Mặc dù sự khác biệt tự nhiên của những người thực hiện kiểm tra đĩa EM, nghiên cứu đã chỉ ra các yếu tố ảnh hưởng chung. Yếu tố chính là kích thước của hạt. Một cách hợp lý, chúng ta có thể coi rằng giới hạn phát hiện chính xác cho mắt người là gần 250µm. Dưới ngưỡng này, tỷ lệ các đối tượng bị bỏ sót trở nên rất cao (hơn 1/3 kết quả âm tính giả). Ngoài kích thước, vị trí và đối lập cũng có thể đóng vai trò trong chất lượng của việc phát hiện.
Kiểm tra hình ảnh giám sát môi trường là một nhiệm vụ thủ công, được thực hiện bởi những người có hiệu suất biến động theo tự nhiên. Cải thiện chất lượng dữ liệu từ kết quả EM dường như khó khăn khi biết về giới hạn này. Phương pháp cần được cải thiện. Công nghiệp Dược phẩm nên xem xét các giải pháp tự động, thay thế việc đếm đĩa truyền thống bằng các tủ nuôi cấy tự động và máy đếm đĩa tự động. Ngoài tính nhất quán trong kết quả, công nghệ này sẽ cải thiện tính toàn vẹn dữ liệu và dẫn đến phân tích xu hướng mạnh mẽ hơn.
Giải pháp 3P® ENTERPRISE đã được phát triển để đáp ứng hoàn toàn các thách thức công nghiệp hàng ngày của EM. 3P® ENTERPRISE là sự kết hợp của ba sản phẩm chính mà, khi được xác nhận và kết hợp cùng nhau, mang lại giá trị đáng kể cho các công ty muốn cải thiện quy trình của họ.
Nhờ vào 3P® STATION, một thiết bị tự động hóa việc ủ và đếm các tảo vi sinh trên các đĩa Petri của Giám sát Môi trường (EM) trong thời gian thực, các trang web dược phẩm hiện đã có khả năng đưa ra các quyết định đáng tin cậy, tối ưu hóa hiệu suất và cải thiện sự tuân thủ.
Sự kết hợp của các thuật toán hiệu suất cao và hình ảnh định nghĩa cao được chụp mỗi giờ đồng nghĩa với việc có một cách đọc tiêu chuẩn của các đĩa – không có lỗi của con người – và cảnh báo sẽ được đưa ra nếu mẫu vượt quá cấu hình của nó, cho phép các biện pháp sửa đổi nhanh chóng. Giải pháp này có thể mang lại những lợi ích hiệu quả đáng kể. Không chỉ các bước đọc thủ công, hiện đang được thực hiện trong phòng thí nghiệm, bị loại bỏ, mà như 3P® STATION có thể được đặt gần hơn với sàn sản xuất, quá trình ủ có thể bắt đầu sớm hơn và do đó kết quả được thu được nhanh chóng hơn, cho phép người dùng ra quyết định chính xác, nhanh chóng hơn. Hệ thống 3P® STATION đã được xác minh cùng với phương pháp thủ công và cung cấp một giải pháp từ đầu đến cuối đã được chứng minh là ít nhất cũng tốt như phương pháp thủ công.
Từ kế hoạch đến báo cáo dữ liệu, các trang web dược phẩm hiện đã có khả năng giám sát kiểm soát EM ở tất cả các giai đoạn của quy trình. 3P® ENTERPRISE là giải pháp để đạt được kết quả nhanh hơn, phát hành sản phẩm sớm hơn cũng như tốc độ quay lại của các dây chuyền sản xuất sau xác nhận vệ sinh. Kết quả là: một sự an tâm lớn hơn nhờ vào việc kiểm soát EM tiêu chuẩn hóa và tiết kiệm tài chính.
Công ty Minh Khang là nhà phân phối độc quyền giải pháp Giám sát môi trường hãng bioMérieux (Pháp).
EN