Tóm tắt
Phát triển dòng tế bào đòi hỏi dây chuyền sản xuất phải bắt đầu từ một tế bào duy nhất. Beckman Coulter mang lại giải pháp đếm tế bào tự động, nhuộm, pha loãng và nuôi cấy tế bào – phương pháp pha loãng giới hạn để đạt được tính đơn dòng. Điều này bao gồm:
- Máy phân tích khả năng sống của tế bào Vi-CELL BLU tích hợp để đếm tế bào tự động
- Pha loãng thể tích lớn với đầu 96 kênh dung tích 1200 μL
- Đĩa ly tâm tích hợp để chụp ảnh ngay lập tức nhằm xác nhận tính đơn dòng
Sự phát triển dòng tế bào
Khía cạnh phát triển dòng tế bào có thể được cho là tạo ra thách thức lớn nhất cho quy trình làm việc là nhu cầu tạo ra dòng tế bào từ một tế bào duy nhất. Yêu cầu này thúc đẩy sản lượng giếng lên đến hàng nghìn khi tìm kiếm bản sao biểu hiện tối ưu. Nó cũng làm tăng đáng kể thời gian cho quy trình vì các tế bào cần nhiều tuần để phát triển đến mức có thể sử dụng và khả năng sống của tế bào thường bị giảm khi nuôi cấy ở cấp độ tế bào đơn lẻ. Ngoài ra còn có thách thức là phân lập một tế bào duy nhất trên mỗi giếng và có một số cách khác nhau để đạt được điều này.
Pha loãng giới hạn là một cách tiếp cận truyền thống để đạt được tính đơn dòng. Nó đòi hỏi phải pha loãng tế bào đến mức trung bình có một tế bào trên một đơn vị thể tích được mạ trong các giếng. Tuy nhiên, như được dự đoán bởi phân phối Poisson, khoảng 1/3 số giếng nuôi cấy sẽ không có tế bào nào, 1/3 số giếng sẽ có một tế bào duy nhất và 1/3 sẽ có nhiều tế bào trên mỗi giếng (Coller và Coller 1986). Sự kém hiệu quả này đã thúc đẩy việc sử dụng các công nghệ thay thế như máy in tế bào đơn hoặc máy phân loại tế bào có thể cung cấp các tế bào đơn trong hầu hết các giếng. Tuy nhiên, chi phí cao của các thiết bị phân loại tế bào này tiếp tục thúc đẩy việc sử dụng pha loãng giới hạn. Ngoài ra, các tế bào thường tiếp xúc với môi trường không vô trùng trước khi đưa vào máy phân loại tế bào, có khả năng dẫn đến nhiễm bẩn, trong khi quá trình phân loại (áp suất, thời gian bên ngoài tủ ấm, v.v.) có thể ảnh hưởng đến khả năng sống của tế bào.
Ở đây, Beckman Coulter mô tả quá trình chuẩn bị mẫu tự động – tự động hóa pha loãng giới hạn trên thiết bị Biomek i7 (Hình 1) khắc phục được một số thách thức liên quan đến quy trình làm việc này. Thông lượng đĩa được kích hoạt thông qua việc sử dụng các thiết bị lưu trữ như bộ nạp đồ dùng phòng thí nghiệm và khả năng tích hợp nhiều thiết bị có thể hỗ trợ các phân tích tự động. Hệ thống sử dụng vỏ bọc được lọc HEPA để duy trì môi trường sạch cho các thao tác tế bào và đầu pipet vô trùng để đảm bảo hơn nữa tính vô trùng của mẫu. Điều này cực kỳ quan trọng đối với quy trình làm việc này vì các môi trường nuôi cấy sẽ được duy trì trong nhiều tuần, cho phép có đủ thời gian để bất kỳ sự lây nhiễm nào lan rộng.
Để tạo ra các khuẩn lạc tế bào đơn lẻ, Biomek Workstation đã pha loãng và phân phối các hỗn dịch tế bào CHO vào Máy phân tích khả năng sống tế bào Vi-CELL BLU tích hợp để đếm. Dựa trên số lượng tế bào thu được, ~83.300 tế bào sau đó được chuyển vào 1 mL calcein AM 0,25 μM và ủ ở 37°C trong 30 phút. Sau khi pha loãng ban đầu gấp 25 lần, ~467 tế bào được thêm vào môi trường tăng trưởng XP CHO A 140 mL (Thiết bị phân tử) sao cho trung bình có một tế bào trên 300 μL. Việc pha loãng mạnh mẽ và làm đầy nhanh bốn đĩa 96 giếng đã đạt được thông qua khả năng hút và phân phối 96 mL cùng một lúc bằng đầu đa kênh có dung tích 1200 μL (Hình 2). Giếng A1 sau đó được lấy ra khỏi tấm đầu tiên và thay thế bằng 300 μL dung dịch pha loãng trung gian với nhiều tế bào hơn 100X để hoạt động như một biện pháp kiểm soát nhằm tối ưu hóa tiêu điểm hình ảnh và thời gian phơi sáng. Các đĩa được quay trong máy ly tâm vi tấm tích hợp (Agilent) ở tốc độ 300 X g trong 3 phút để đảm bảo bất kỳ tế bào nào cũng ở dưới cùng của đĩa để chụp ảnh ngay lập tức trên CloneSelect (Hình 3A, Thiết bị phân tử). Bằng cách loại bỏ thời gian để tất cả các tế bào lắng xuống, Beckman Coulter đã giảm thiểu khả năng phân chia tế bào sớm và/hoặc dòng chảy nhuộm calcein dẫn đến kết quả âm tính giả.
Hình 3B cho thấy kết quả hình ảnh của đĩa điển hình sau khi pha loãng giới hạn tự động. Các giếng đơn dòng (xanh lá cây/vàng) được phân biệt với các giếng không có tế bào (trắng) hoặc nhiều tế bào (đỏ). Để xác định tính đủ của việc pha loãng trong bể với thể tích lớn, Beckman Coulter đã phân tích tần suất đơn dòng ở mỗi vị trí đĩa trong năm thí nghiệm (20 giếng).
Hình 4A cho thấy sự phân bố kết quả và không phát hiện thấy sai lệch vị trí rõ rệt nào. Sự nhất quán giữa các thí nghiệm được chứng minh trong Hình 4B, trong đó tần suất trung bình của các giếng đơn dòng trong năm thí nghiệm cho thấy sự phân bố hẹp (CV = 8,6%), ở hoặc gần tần suất dự kiến cho phương pháp pha loãng giới hạn.
Mặc dù việc hạn chế pha loãng không thể đạt được hiệu quả của phương pháp phân loại tế bào đối với đơn dòng, nhưng việc tự động hóa quá trình nuôi cấy và phân tích này như một phần của hệ thống phát triển dòng tế bào tự động lớn hơn có thể giảm bớt nỗ lực cần thiết để đạt được thông lượng cần thiết để xác định các bản sao tối ưu đồng thời loại bỏ nhu cầu sử dụng các thiết bị bổ sung tốn kém hơn
Tài liệu tham khảo
Coller, HA & Coller, BS (1986) Phân tích thống kê Poisson về việc nhân bản lặp lại bằng kỹ thuật pha loãng giới hạn như một cách đánh giá tính đơn dòng của tế bào lai. Phương pháp Enzymol, 121, 412-417. doi:10.1016/0076-6879(86)21039-3
* Hệ thống Biomek không được thiết kế hoặc xác nhận để sử dụng trong chẩn đoán bệnh hoặc các tình trạng khác. Kits thuốc thử bộ gen của Beckman Coulter Life Sciences chỉ dành cho mục đích nghiên cứu.
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp thiết bị phân tích khả năng sống của tế bào và hệ thống chuẩn bị mẫu tự động hãng Beckman Coulter.
EN