Sàng lọc chiết xuất nấm men để cải thiện sản xuất sinh khối trong nuôi cấy ban đầu vi khuẩn axit axetic

Giới thiệu

Trong nhiều năm qua, nhu cầu về đồ uống lên men tự nhiên như kombucha, kefir, water kefir và kwass đã tăng đáng kể. Theo truyền thống, các sản phẩm lên men chua này được sản xuất bởi các nhóm vi khuẩn và/hoặc nấm men không xác định. Việc thiếu định nghĩa về các nhóm này cản trở sản xuất quy mô công nghiệp do sự thay đổi về chi phí và các mối quan tâm liên quan đến tính ổn định của vi khuẩn và sự phân hủy sản phẩm. Do đó, việc áp dụng các ‘nuôi cấy ban đầu’ được xác định giúp giảm bớt một số mối quan tâm về sản xuất này, đặc biệt là tính ổn định và khả năng tái tạo của sản phẩm.

Trong trường hợp của kombucha, nhóm vi khuẩn được gọi là SCOBY ( Symbiotic Culture Of Bacteria and Yeast ), chủ yếu bao gồm vi khuẩn axit axetic (ví dụ Acetobacter spp., Gluconobacter spp., Gluconacetobacter spp. và Komagataeibacter spp.) và nấm men (ví dụ Brettanomyces spp. và Zygosaccharomyces spp.) cũng như trong một số trường hợp là vi khuẩn axit lactic. Trà có đường được sử dụng làm cơ sở và thông qua quá trình lên men trở thành một loại đồ uống giải khát có nhu cầu thị trường tương đối cao.

Sử dụng môi trường phức hợp có nguồn gốc kinh tế với hàm lượng dinh dưỡng phù hợp là chìa khóa để các nhà sản xuất nuôi cấy khởi động tối đa hóa năng suất. Có nhiều loại chiết xuất nấm men khác nhau có thể đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của các vi sinh vật đòi hỏi khắt khe, bằng cách bao gồm

• lượng lớn axit amin tự do,
• lượng lớn peptone và/hoặc
• hàm lượng nucleotide cao.

Môi trường lựa chọn tất nhiên phụ thuộc vào chủng và điều kiện nuôi cấy. Do đó, sản xuất sinh khối có lợi nhuận đòi hỏi phải có các thí nghiệm sàng lọc để xác định các điều kiện quy trình tối ưu.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chứng minh rằng BioLector^® là một thiết bị phù hợp để sàng lọc chủng trực tuyến và để nghiên cứu tác động của các chiết xuất nấm men khác nhau lên sản xuất sinh khối của vi khuẩn axit axetic Komagataeibacter hansenii Ko-0201. Các thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện pH được kiểm soát và không được kiểm soát.

Phương pháp

Chủng nuôi cấy

Komagataeibacter hansenii Ko-0201 được lấy từ bộ sưu tập chủng VLB.

Môi trường nuôi cấy

Môi trường chiết xuất nấm men dextrose được chuẩn bị bao gồm 50g/L glucose và 10g/L chiết xuất nấm men tương ứng:

• SERVABACTER ^® , Save Electrophoresis GmbH; lô kiểm soát
• X-SEED ^® KAT, Ohly GmbH; giàu axit amin tự do
• X-SEED ^® Nucleo Advanced, Ohly GmbH; giàu ribonucleotide tự do
• X-SEED ^® Nucleo Max, Ohly GmbH; được làm giàu thêm trong ribonucleotide tự do
• X-SEED ^® Peptone, Ohly GmbH; giàu peptide nhỏ

Độ pH được điều chỉnh đến 5,5 trước khi khử trùng bằng phương pháp hấp tiệt trùng. Các môi trường tương ứng cũng được trộn với thể tích bằng nhau với trà xanh (2g/L lá trà xanh + 60g/L glucose) như một môi trường thay thế để thích nghi với quá trình lên men kombucha sau này.

Điều kiện nuôi cấy trong BioLector^®

Tiền nuôi cấy hai giai đoạn của vi khuẩn axit axetic được tiến hành trong môi trường YED với SERVABACTER ^® dưới dạng chiết xuất nấm men trong bình lắc ở 30°C. Từ tiền nuôi cấy thứ hai, quá trình lên men chính không kiểm soát pH được bắt đầu trong FlowerPlate^® 48 giếng (MTP-48-BOH3) cho phép sàng lọc pH đáng tin cậy và không xâm lấn trong phạm vi từ pH4 đến 6. Hơn nữa, pH được đo quang học trong quang phổ hồng ngoại, để giảm khả năng gây nhiễu của huỳnh quang nền trong môi trường nuôi cấy. 1 mL môi trường nuôi cấy tương ứng được tiêm vào mật độ tế bào là 10⁷ tế bào/mL. Đĩa được lắc ở tốc độ 1400 vòng/phút và ủ ở 30°C.

Hệ thống vi lỏng FlowerPlate^® là hệ thống được lựa chọn để kiểm soát độ pH thông qua công nghệ chip vi lỏng. Các đầu dò quang pH thấp (MTP-MF32- BOH3) đo độ pH của quá trình nuôi cấy và bộ điều khiển phản hồi từ Biolector^® khởi tạo quá trình điều chế độ pH đến điểm đặt thông qua các kênh vi lỏng ở đáy đĩa. Đối với ứng dụng này, 800µL môi trường nuôi cấy tương ứng đã được tiêm vào mật độ tế bào là 10⁷ tế bào/mL. Hệ thống vi lỏng FlowerPlate^® được lắc ở tốc độ 1200 vòng/phút và 30°C. Độ pH được điều chỉnh lên trên 4,5 hoặc 5,5 tương ứng với 10% KOH. Vào một số thời điểm nhất định, các mẫu được lấy để đo độ pH ngoại tuyến thông qua máy đo pH (testo 206-pH2) và nồng độ tế bào thông qua Bộ đếm Multisizer 4e Coulter

Các phép đo trực tuyến trong các mô-đun lọc BioLector^®

Sinh khối (ID 401), pH-51 (ID 424) và oxy hòa tan (DO) (ID 228) được sử dụng để theo dõi quy trình trực tuyến.

Kết quả

Sàng lọc chiết xuất nấm men không kiểm soát pH:

Trong thí nghiệm đầu tiên, quá trình hình thành sinh khối được đánh giá trong môi trường chứa các chiết xuất nấm men khác nhau có và không có bổ sung trà. Kết quả cho thấy (hình 2) rằng sinh khối cao nhất sau 44 giờ lên men đạt được trong môi trường YED có X-SEED ^® KAT (với 25,37au hoặc 5,52·10⁹ tế bào/mL) cũng như chiết xuất nấm men X-SEED ^® Peptone (với 24,36au hoặc 4,42·10 ⁹ tế bào/mL) mà không bổ sung trà. Khi sử dụng môi trường nuôi cấy bổ sung trà, X-SEED ^® KAT vượt trội hơn X-SEED ^® Peptone. Điều này cũng được thấy trong các phép đo nồng độ tế bào ngoại tuyến như thể hiện trong bảng 1. Các giá trị sinh khối thấp nhất đạt được khi sử dụng SERVABACTER^® với 13,94 a.u. và 11,55au (2,31·10 ⁹ tế bào/mL và 1,75·10⁹ tế bào/mL) và chiết xuất nấm men X‑SEED^® Nucleo Advanced với 15,96 a.u. và 12,98au (2,44 · 10⁹ tế bào/mL và 1,93·10 ⁹ tế bào/mL).

Bảng 1 : Dữ liệu trực tuyến và ngoại tuyến để đánh giá kết quả sinh khối K.hansenii sau 44 giờ tùy thuộc vào chiết xuất nấm men được sử dụng.

Môi trường nuôi cấy	Sinh khối [au]	Nồng độ tế bào [tế bào/mL]
SERVABACTER®	13,94	2,31∙109
SERVABACTER ® + trà xanh	11,55	1,75∙109
X-SEED ® KAT	25,37	5,52∙109
X-SEED ® KAT + trà xanh	17.22	3.01∙109
X-SEED ® Nucleo Max	16,88	2,77∙109
X-SEED ® Nucleo Max + trà xanh	13.39	2,00∙109
X-SEED ® Nucleo Nâng cao 9	15,96	2,44∙109
X-SEED ® Nucleo Advanced + trà xanh	12,98	1,93∙109
Pepton X-SEED ®	24,36	4.22∙109
X-SEED ® Peptone + trà xanh	12.29	1,50∙109
X-SEED ® KAT + X-SEED ® Nucleo Max	21,67	4.22∙109
X-SEED ® KAT + X-SEED ® Nucleo Max + trà xanh	15,50	2,26∙ 109

Giá trị pH đo trực tuyến cho thấy môi trường bị axit hóa mạnh dẫn đến giá trị pH cuối cùng rõ ràng dưới 4 như trình bày trong hình 3.

Do đó, để tăng hiệu quả sản xuất sinh khối, các thí nghiệm được kiểm soát pH đã được tiến hành bằng cách sử dụng X-SEED ^® KAT làm chiết xuất nấm men có hiệu suất tốt nhất.

Sàng lọc chiết xuất nấm men ở độ pH được kiểm soát

K.hansenii Ko-0201 được lên men trong môi trường YED bằng cách sử dụng X-SEED ^® KAT làm chiết xuất nấm men ở độ pH được kiểm soát là 5,5 hoặc 4,5 sau hai giờ hoặc quá trình axit hóa tự nhiên. Các thí nghiệm được kiểm soát ở độ pH 4,5 giảm DO sớm hơn một chút so với các thí nghiệm ở độ pH 5,5 như thể hiện trong hình 4 và hình 5. Hơn nữa, các giá trị sinh khối cao hơn đã đạt được ở độ pH 4,5 sau 30 giờ lên men.

Quan sát trong tín hiệu sinh khối trực tuyến cũng được phản ánh bằng các phép đo ngoại tuyến của nồng độ tế bào tương ứng được liệt kê trong Bảng 2 : Với giá trị sinh khối cuối cùng là 34,55au (hoặc 7,2 · 10 ⁹ tế bào/mL) ở pH4,5 so với giá trị sinh khối cuối cùng là 28,24au (hoặc 6,46 · 10 ⁹ tế bào/mL) ở pH5,5.

Bảng 2 : Dữ liệu trực tuyến và ngoại tuyến để đánh giá kết quả sinh khối K.hansenii với X-SEED ^® KAT sau 30 giờ tùy thuộc vào độ pH lên men. Giá trị trung bình của ba bản sao sinh học ở độ pH 5,5 và bản sao ở độ pH 4,5.

Cài đặt	Sinh khối [au]	Nồng độ tế bào [tế bào/mL]
YED với X-SEED ® KAT được kiểm soát ở pH 5,5	28.24	6,46∙10 9
YED với X-SEED ® KAT được kiểm soát ở pH 4,5	34,55	7.20∙10 9

Các giá trị pH được kiểm soát và đo trực tuyến phù hợp tốt với các phép đo ngoại tuyến như trình bày trong hình 6, nhấn mạnh tính phù hợp của quang cực pH thấp để sản xuất nuôi cấy khởi động vi khuẩn axit axetic.

Để kết luận, chúng tôi đã đạt được sản lượng sinh khối cải thiện của K. hansenii Ko-0201 trong X-SEED ^® KAT bằng cách kiểm soát độ pH. Hơn nữa, việc kiểm soát độ pH trong phạm vi độ pH thấp từ 4,5 đến 5,5 đã thành công và đạt được mối tương quan tốt giữa các giá trị trực tuyến và ngoại tuyến.

Phần kết luận

Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho quá trình sản xuất sinh khối hiệu quả cuối cùng sẽ mang lại kết quả trong quá trình sản xuất ban đầu

Ở đây, một sàng lọc chiết xuất nấm men để sản xuất sinh khối của vi khuẩn axit axetic Komagataeibacter hansenii Ko-0201 đã được tiến hành ở các giá trị pH lên men khá thấp. Do đó, FlowerPlates^® vi lỏng được trang bị optode pH thấp đã chứng minh là phù hợp để đáp ứng nhu cầu đo pH trực tuyến thích hợp cũng như kiểm soát pH.

Sử dụng X-SEED^® KAT (Ohly GmbH, Đức) làm chiết xuất nấm men, được bổ sung với các axit amin tự do, có thể đạt được mật độ tế bào K.hansenii cao lên tới 7,20 10⁹ tế bào/mL trong quá trình lên men theo mẻ có kiểm soát pH.

Nguồn: https://www.beckman.com/resources/reading-material/application-notes/screening-yeast-extract-to-improve-biomass-production-in-acetic-acid-bacteria-starter-culture

Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp thiết bị Lò phản ứng vi sinh hãng Beckman Coulter.