Phân tích các tế bào và mô yêu cầu phải chuẩn bị các phần (lát cắt) mỏng, chất lượng gắn trên lam kính và được nhuộm màu để xác định cấu trúc bình thường hoặc bất thường.
Hầu hết các mô tươi đều rất mỏng, dễ bị biến dạng và tổn hại, do đó không thể chuẩn bị các phần mỏng trừ khi mô được bảo quản hoặc “cố định” bằng hóa chất trong khi nó đang được cắt. Có 2 cách để bảo quản mô như sau:
- Trữ đông mô và luôn giữ mô lạnh trong khi cắt.
- Ngoài ra, có thể vùi mẫu mô với chất rắn dạng sáp (parafin)
Bài viết này mô tả các phương pháp xử lý mô bằng cách vùi mô trong parafin chuẩn bị cho việc cắt lát.
Giới thiệu
Xử lý mô mô tả các bước cần thiết để đưa mô của động vật hoặc người từ trạng thái cố định sang trạng thái được vùi hoàn toàn trong sáp, sẵn sàng để cắt thành các phần mỏng.
Quá trình xử lý mô có thể được thực hiện thủ công, nhưng khi phải xử lý nhiều mẫu thì việc sử dụng Máy xử lý mô tự động sẽ tiện lợi và hiệu quả hơn. Những thiết bị này đã có từ những năm 1940 và đã dần phát triển để sử dụng an toàn, xử lý nhiều mẫu nhanh hơn và tạo ra kết quả chất lượng tốt. Có 2 loại máy chính: máy xử lý mô dạng xoay tròn (mẫu vật được chuyển tải từ vật chứa này sang vật chứa khác) và máy xử lý mô hệ kín (mẫu vật được giữ trong buồng chưng độc lập và hoá chất được truyền vào và ra theo yêu cầu). Hầu hết hệ thống quản lý hoá chất hiện đại sử dụng nhiệt độ cao, lưu thông chất lỏng hiệu quả và kết hợp các chu kỳ chân không/áp suất để tăng cường và giảm thời gian xử lý.
Tầm quan trọng của xử lý mô
Việc xử dụng lịch trình xử lý không phù hợp hoặc mắc các lỗi cơ bản trong việc bổ sung hoặc sắp xếp hoá chất có thể tạo ra mẫu mô không thể cắt lát được. Điều này sẽ rất nghiêm trọng trong khi xử lý mô ở người vì không có mô dự phòng và mô được chẩn đoán. Các lỗi do máy xử lý mô gây ra sẽ ít tổn hại hơn các mô xử lý thủ công.
Tổng quan về các bước xử lý mô cho các phần parafin
1. Lấy bệnh phẩm tươi
Các mẫu mô tươi sẽ đến từ nhiều nguồn khác nhau. Cần lưu ý rằng chúng rất dễ bị tổn hại trong quá trình lấy ra từ bệnh nhân hoặc động vật. Điều quan trọng là cần xử lý cẩn thận và cố định mô càng sớm xàng tốt sau khi giải phẫu.
2. Cố định mô
Mẫu vật được đặt trong chất cố định mô (fixative) như dung dịch formaldehyde (formalin). Hoá chất sẽ từ từ thấm vào mô để làm cứng mô và bảo quản quản mô cho các bước tiếp theo. Formalin, thường ở dạng dung dịch đệm photphat, là chất cố định mô phổ biến để bảo quản mô và chuẩn bị cho phần vùi parafin. Các mẫu vật nên được đặt trong chất cố định mô đủ lâu cho đến khi đạt đến trạng thái cân bằng (khoảng 6 – 24h)
Sau khi cố định, các mẫu có thể được yêu cầu thêm các phần cắt lát để kiểm tra. Mẫu bệnh phẩm sẽ được đặt trong các hộp có dán nhãn để phân biệt. Thời gian xử lý mẫu vật sẽ phụ thuộc vào từng loại và kích thước của mẫu, thực hiện cùng bộ xử lý và tuỳ chọn dung môi, nhiệt độ dung môi…
3. Khử nước
Vì sáp paraffin nóng chảy kỵ nước (không thể trộn lẫn với nước), phần lớn phải loại nước trong mẫu vật trước khi sáp có thể thấm vào. Quá trình này thường được thực hiện bằng cách vùi mẫu vào một loạt dung dịch etanol (rượu) có nồng độ tăng dần cho đến khi đạt được độ cồn tinh khiết, không chứa nước. Ethanol có thể trộn với nước theo mọi tỷ lệ sao cho nước dần dần được thay thế bằng cồn.
Trình tự khử nước điển hình cho mẫu dày không quá 4 mm như sau
- 70% etanol 15 phút
- 90% etanol 15 phút
- 100% ethanol 15 phút
- 100% ethanol 15 phút
- 100% ethanol 30 phút
- 100% ethanol 45 phút
4. Làm sạch
Sau khi khử nước, vì sáp và etanol cũng không thể trộn lẫn được nên phải sử dụng một dung môi trung gian để hoà trộn với cả etanol và parafin. Dung môi này sẽ thay thế ethanol trong mô, sau đó chất này sẽ bị thay thế bởi sáp parafin nóng chảy. Giai đoạn này được gọi là làm sạch, dung môi được sử dụng gọi là chất làm sạch. Chất làm sạch mang lại độ trong quang học cho mô do có chỉ số khúc xạ tương đối cao và có khả năng loại bỏ một lượng chất béo đáng kể trong mô.
Chất làm sạch phổ biến là xylene. Trình tự làm sạch điển hình cho các mẫu dày không quá 4mm sẽ là:
- xylen 20 phút
- xylen 20 phút
- xylen 45 phút
5. Tẩm sáp
Các mô bây giờ thích hợp để tẩm sáp dạng lỏng ở nhiệt độ 60°C, để nguội xuống 20°C, sau đó sáp sẽ đông lại thành khối rắn và cho phép để cắt mô. Những loại sáp này là hỗn hợp của sáp parafin tinh khiết và các chất phụ gia khác nhau bao gồm các loại nhựa như styren hoặc polyetylen. Công thức sáp này cho phép các mô đã tẩm sáp được cắt ở Máy cắt lát với độ dày mỏng đến 2 µm.
Trình tự tẩm sáp điển hình cho các mẫu dày không quá 4mm sẽ là:
- sáp 30 phút
- sáp 30 phút
- sáp 45 phút
6. Vùi mô
Sau khi mẫu vật đã được tẩm kỹ bằng sáp, nó phải được tạo thành một khối để có thể kẹp vào Máy cắt lát. Bước này được thực hiện bằng cách sử dụng một “hệ thống vùi mô”, trong đó khuôn được đổ đầy sáp nóng chảy và mẫu vặt đặt trong đó. Định hướng mẫu vật chính xác để xác định mặt phẳng cần cắt. Đặt cassette vào khuôn, phủ thêm sáp lên trên và đặt toàn bộ trên tấm lạnh để đông lại. Khi hoàn tất quá trình, lấy các khối và cassettle ra khỏi khuôn để sẵn sàng cho việt cát lát.
Quy trình “không chứa Xylene”
Mặc dù xylene được sử dụng rộng rãi như một chất làm sạch mô, nhưng quá trình xử lý nó lại là một chất phản ứng độc hại. Một số phòng thí nghiệm sử dụng các chất thay thế ít độc hơn như isopropanol hoặc các chất thay thế xylen khác. Để phương pháp này thành công, cần có nhiệt độ sáp cao hơn để có thể loại bỏ isopropanol khỏi mẫu vật trong quá trình tẩm
Các tác động kết hợp của quá trình cố định và xử lý là làm cứng mô. Có ước tính rằng các mô cứng lại tới 20% hoặc hơn 20% khi chúng được tẩm sáp. Tuy nhiên, các lát cắt được xử lý tối ưu cho phép thực hiện so sánh giữa các mẫu vật và xác định chẩn đoán mô bệnh học một cách chính xác.
Về mặt lý thuyết và thực tế, các khối paraffin dễ cắt nhất chứa mô tương đối đồng nhất có độ đặc mềm đồng nhất (chẳng hạn như thận), khi được tẩm sáp sẽ có độ đặc tương tự như sáp đông đặc (không chứa mô) . Các mô có tính chất đặc hoặc xơ hoặc mẫu vật có cả mô cứng và mô mềm trong các lớp rời rạc có thể gây ra nhiều thách thức.
Các bước để xử lý mô và vùi mô tốt hơn
Chuẩn bị các mẫu mô đòi hỏi phải cẩn thận, có kỹ năng và quy trình hợp lý. Dưới đây cung cấp các giải pháp để thực hiện tốt nhất và các cách để tránh các lỗi phổ biến.
- Sử dụng một lịch trình phù hợp
- Cố định mô bổ sung trong trườn hợp mô cố định không hoàn toàn
- Duy trì hoá chất chất lượng
- Tránh sử dụng thuốc thử nguy hiểm
- Định hướng mẫu chính xác
- Chọn khuôn thích hợp cho từng loại mô
- Xử lý mẫu vật nhẹ nhàng
- Tránh nhiệt độ quá cao
Nguồn: https://www.leicabiosystems.com/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing/
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các thiết bị Giải phẫu bệnh từ hãng Leica Biosystems.
EN