Quy trình kỹ thuật cố định mô từ Leica Biosystems

Việc cố định mô có thể đạt được bằng các biện pháp vật lý hoặc hóa học. Các phương pháp vật lý bao gồm gia nhiệt, vi sóng và bảo quản lạnh. Việc cố định nhiệt hiếm khi được sử dụng trên các mẫu mô, ứng dụng của nó chỉ giới hạn ở các vết nhuộm của vi sinh vật. Tuy nhiên, cố định vi sóng, có thể được coi là một dạng cố định nhiệt, hiện nay được thực hành rộng rãi trong các phòng thí nghiệm thông thường. Bảo quản lạnh, thường ở dạng đông khô, có một số ứng dụng trong mô hóa học nhưng thường không được áp dụng cho các mẫu mô chẩn đoán.

Cố định hóa học thường đạt được bằng cách ngâm mẫu vật vào chất cố định hoặc, trong trường hợp động vật nhỏ hoặc toàn bộ một số cơ quan như phổi, bằng cách tưới máu hệ thống mạch máu bằng chất cố định (cố định tưới máu). Đối với một số quy trình mô hóa chuyên biệt, chất cố định đôi khi được áp dụng ở dạng hơi. Ví dụ, paraformaldehyde và osmium tetroxide có thể được sử dụng để cố định hơi cho các mô đông khô.

Dung dịch cố định có thể chứa một chất cố định hòa tan trong dung môi như nước hoặc cồn hoặc phổ biến hơn là dung dịch đệm để ổn định độ pH. Một số giải pháp cố định phổ biến có chứa nhiều chất cố định khác nhau kết hợp với nhau, lý do là những khiếm khuyết ở một chất cố định có thể được bù đắp bằng cách bổ sung một chất cố định khác. Ví dụ, axit axetic có mặt trong một số công thức để chống lại sự co ngót do các tác nhân khác như ethanol gây ra.

Sự cố định có thể được coi là “một chuỗi các sự kiện hóa học phức tạp”. Mặc dù bây giờ chúng ta có thể định nghĩa một số “sự kiện” này nhưng sự hiểu biết của chúng ta về phần lớn những gì xảy ra trong quá trình cố định vẫn chưa đầy đủ. Tế bào và các thành phần ngoại bào chứa peptide và protein, lipid và phospholipid (màng), phức hợp carbohydrate và carbohydrate, nhiều loại RNA và DNA, v.v. Các yếu tố này sẽ phản ứng như thế nào trong quá trình cố định sẽ phụ thuộc vào loại cố định, chất cố định được sử dụng và các điều kiện cố định. Một số thành phần mô sẽ phản ứng hóa học với chất cố định, được ổn định bằng liên kết ngang và do đó được bảo tồn, những thành phần khác có thể không bị ảnh hưởng bởi chất cố định nhưng bị giữ lại trong tế bào hoặc mô bởi các thành phần cố định khác.

Các chất cố định truyền thống được gọi là “chất đông tụ” hoặc “chất không đông tụ” dựa trên tác dụng của chúng lên các protein hòa tan trong dung dịch.  Chất cố định đông tụ được cho là tạo ra một mạng lưới có tính thấm của các chuỗi protein trong khi các chất cố định không đông tụ có bản chất phụ gia, tạo thành các liên kết ngang rộng tạo ra gel ít thấm hơn.

Có hai cơ chế chính quan trọng trong việc cố định protein và phức hợp protein: biến tính, cộng và hình thành liên kết ngang.

Biến tính:  Thông thường nhất, hiệu ứng này được gây ra bởi các chất khử nước như cồn hoặc axeton. Những thuốc thử này loại bỏ và thay thế nước tự do trong tế bào và mô và gây ra sự thay đổi cấu trúc cấp ba của protein bằng cách làm mất ổn định liên kết kỵ nước. Các vùng kỵ nước, thường được tìm thấy ở bên trong các phân tử protein, được giải phóng khỏi lực đẩy của nước và trở nên tự do chiếm một diện tích lớn hơn. Trong vùng ưa nước của protein, các phân tử nước bị liên kết lỏng lẻo bởi các liên kết hydro và việc loại bỏ nước cũng làm mất ổn định các liên kết này. Những thay đổi về hình dạng của các phân tử protein gây ra sự thay đổi về độ hòa tan của protein, khiến protein hòa tan trong nước không hòa tan, một sự thay đổi phần lớn không thể đảo ngược nếu protein được đưa trở lại môi trường nước.

Bổ sung và hình thành liên kết chéo:  Các chất cố định không đông máu phản ứng hóa học với protein và các thành phần tế bào và mô khác, trở nên liên kết với chúng bằng cách bổ sung và hình thành các liên kết ngang giữa các phân tử và nội phân tử. Bởi vì các tác nhân này là những hợp chất phản ứng nên chúng liên kết với nhiều nhóm hóa học khác nhau trong mô, thường ảnh hưởng đến điện tích tại vị trí gắn kết. Điều này có thể ảnh hưởng đến các đặc tính nhuộm màu tiếp theo của một loại protein cụ thể cũng như làm thay đổi cấu trúc phân tử và do đó làm thay đổi độ hòa tan của nó. Ví dụ, mô được cố định bằng formaldehyde sẽ nhuộm kém eosin vì formaldehyde phản ứng mạnh với các nhóm amino để tạo thành cầu methylene và do đó các nhóm này không còn khả năng liên kết các phân tử thuốc nhuộm tích điện âm như eosin.

Mức độ mà chất cố định phụ gia hình thành liên kết chéo thay đổi đáng kể. Ví dụ, glutaraldehyde có hiệu quả hơn trong việc hình thành các liên kết chéo so với formaldehyde. Điều này giải thích tại sao nó bảo tồn một cách hiệu quả cấu trúc siêu nhỏ của tế bào và là chất cố định được lựa chọn cho kính hiển vi điện tử. Nó cũng giải thích tại sao các mô được cố định bằng glutaraldehyde lại khó nhuộm màu bằng các phương pháp nhuộm thông thường. Các phản ứng hóa học của quá trình cố định mô đã được hiểu khá rõ trong trường hợp một số tác nhân như formaldehyde nhưng kiến ​​thức về các cơ chế liên quan đến một số tác nhân khác vẫn chưa đầy đủ.

Các phương pháp thu hồi kháng nguyên trong hóa mô miễn dịch đã chỉ ra rằng một số phản ứng cố định có thể đảo ngược, đặc biệt là phản ứng của formaldehyde, nhưng có sự khác biệt đáng kể về chất lượng bảo quản kháng nguyên với các tác nhân khác nhau. Việc bảo tồn tính kháng nguyên đã trở thành một vấn đề rất quan trọng khi lựa chọn chất cố định.

Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các thiết bị Giải phẫu bệnh từ hãng Leica Biosystems.