Giới thiệu
Probiotics là vi khuẩn có lợi, tăng cường sức khỏe và tác dụng sinh học đối với cơ thể con người. Chúng thường được sử dụng để tăng số lượng vi khuẩn mong muốn và tái tạo hệ vi khuẩn đường ruột, ví dụ sau khi điều trị bằng kháng sinh. Đó là một lý do tại sao các thực phẩm bổ sung dinh dưỡng probiotics đã tăng giá trị đáng kể. Lĩnh vực nghiên cứu về hệ vi sinh vật đường ruột của con người và những lợi ích tăng cường sức khỏe của nó đặc biệt quan trọng đối với ngành dinh dưỡng. Do đó, nghiên cứu khoa học về các kỹ thuật nuôi cấy kỵ khí hoặc vi hiếu khí, chẳng hạn như nuôi cấy probiotics trong điều kiện giống như hệ vi sinh vật, là điều cần thiết. Probiotics bao gồm toàn bộ các loại vi khuẩn kỵ khí như Lactobacillus hoặc Bifidobacterium . Trong số các loại vi khuẩn probiotic khác nhau, Bifidobacterium spp. là một trong những loài vi khuẩn probiotic được sử dụng và nghiên cứu rộng rãi nhất. Chúng được phân loại là vi khuẩn kỵ khí bắt buộc do không có khả năng hô hấp oxy và phát triển trong điều kiện nuôi cấy hiếu khí an chúng là thành viên chính của hệ vi khuẩn đường ruột chiếm ưu thế của con người
Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát độ pH thông qua việc giải phóng axit lactic và axit axetic, hạn chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh tiềm ẩn. Trong đường ruột của trẻ sơ sinh dùng sữa mẹ, Bifidobacterium là loài tế bào chiếm ưu thế. Nó chiếm hơn 80% vi sinh vật trong đường ruột. Có hơn 200 loài Lactobacillus đã biết, chi lớn nhất và đa dạng nhất trong số các vi khuẩn axit lactic được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận là an toàn (GRAS). Lactobacillus spp. đã được triển khai và nghiên cứu rộng rãi như các vi khuẩn khởi đầu lên men cho các sản phẩm từ sữa hoặc men vi sinh do tiềm năng ứng dụng của chúng đối với sức khỏe.
Trong App Note này, Beckman Coulter trình bày các thí nghiệm nuôi cấy kỵ khí sử dụng hệ thống nuôi cấy vi sinh BioLector XT kết hợp với nắp cấp khí. Hệ thống nuôi cấy vi sinh BioLector XT là thiết bị để bàn để sàng lọc với thông lượng cao các nuôi cấy vi sinh vật cho phép theo dõi trực tuyến các thông số nuôi cấy phổ biến nhất như sinh khối, giá trị pH, độ bão hòa oxy của pha lỏng (DO) và cường độ huỳnh quang của nhiều phân tử hoặc protein huỳnh quang khác nhau. Để đạt được thông lượng cao, nuôi cấy được thực hiện trong các đĩa vi mô định dạng chuẩn SBS/SLAS với 48 giếng mỗi đĩa, cho phép chạy đồng thời tới 48 mẻ trong một hệ thống BioLector XT. Hơn nữa, Beckman Coulter cũng trình bày sự đơn giản khi sử dụng nắp cấp khí của BioLector XT (hình 1) để thực hiện nuôi cấy theo mẻ kỵ khí và nuôi cấy theo mẻ bổ sung các vi khuẩn probiotic Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum và Bifidobacterium bifidum. Một lợi thế chính của nắp cấp khí hệ thống nuôi cấy vi sinh BioLector XT là việc cấp khí và kiểm soát pH hiện có thể diễn ra đồng thời trong quá trình cấp khí nitơ trực tiếp (ví dụ: 100% N2) vào đĩa vi mô (MTP) với lưu lượng có thể điều chỉnh trong khoảng 5 – 50 mL/phút.
Phương pháp
Nuôi cấy kỵ khí các chủng Lactobacillus
Tất cả các quá trình nuôi cấy Lactobacillus spp. (Lactobacillus casei DSM 20011 hoặc Lactobacillus plantarum DSM 20174) đều diễn ra trong môi trường nuôi cấy MRS (Carl Roth, Đức) ở nhiệt độ môi trường 37°C và trong điều kiện kỵ khí. Môi trường nuôi cấy MRS được làm giàu bằng 0,5 g/L cysteine-HCl đóng vai trò là chất khử cho thế oxy hóa-khử bằng cách giảm O2 phân tử còn lại trong môi trường. Tất cả các quá trình nuôi cấy trước đều được thực hiện trong bình Erlenmeyer 250 mL. Với mục đích này, 20 mL môi trường nuôi cấy MRS đã chuẩn bị được tiêm 1 mL nuôi cấy đông lạnh và sau đó nuôi cấy trong ít nhất 24 giờ trong điều kiện kỵ khí. Sau đó, nuôi cấy chính được thiết lập thành ODstart = 1 trong môi trường nuôi cấy MRS. Các quá trình nuôi cấy vi sinh BioLector XT tiếp theo được thực hiện trong Đĩa giếng tròn vi lưu NextGen để nuôi cấy theo mẻ có kiểm soát pH và nuôi cấy theo mẻ chất bổ sung. Các quá trình nuôi cấy được tiến hành ở 37°C, 600 vòng/phút và cho phép kiểm soát độ ẩm. Thể tích ban đầu của các giếng nuôi cấy được đặt ở mức 2.000 µL và thể tích tối đa là 2.400 µL. Giám sát trực tuyến sinh khối (gain 3) và đo pH (LG1) và oxy hòa tan DO (RF) được thực hiện bằng BioLector XT. Tổng quan chi tiết hơn về các điều kiện nuôi cấy theo mẻ của L. casei được thể hiện trong bảng 1.
| Hàm lượng | Cài đặt vi lưu | |
|---|---|---|
| Reservoir a (chất bổ sung) | 500 g/L glucose |
|
| Reservoir b (kiểm soát độ pH) | 3M NaOH |
|
| Giếng nuôi cấy | L. casei trong môi trường nuôi cấy MRS |
|
Bảng 1. Điều kiện nuôi cấy theo mẻ cho L. casei
Nuôi cấy kỵ khí B. bifidum với hệ thống nuôi cấy vi sinh BioLector XT
Tất cả các quá trình nuôi cấy Bifidobacterium bifidum (SinoPlaSan AG, Đức) đều được thực hiện trong môi trường nuôi cấy MRS (Carl Roth, Đức) ở nhiệt độ 37°C và trong điều kiện kỵ khí. Môi trường nuôi cấy MRS được làm giàu bằng 0,5 g/L cysteine-HCl đóng vai trò là chất khử cho thế oxy hóa-khử bằng cách khử phân tử O2 còn lại trong môi trường. Quá trình nuôi cấy trước khi nuôi cấy diễn ra trong bình Erlenmeyer 250 mL. Với mục đích này, 20 mL môi trường nuôi cấy MRS được tiêm chủng với nội dung của một viên nang và sau đó nuôi cấy trong ít nhất 24 giờ ở 37°C trong điều kiện kỵ khí. Nuôi cấy chính được thiết lập thành ODstart=1.0 trong môi trường nuôi cấy MRS.
Đối với nuôi cấy chính trong BioLector XT, các đợt nuôi cấy được kiểm soát pH và nuôi cấy theo mẻ chất bổ sung ở 37°C, 600 vòng/phút, cho phép kiểm soát độ ẩm, theo dõi trực tuyến sinh khối (tăng 3), pH (LG1) và DO (RF) đã được thực hiện. Tổng quan chi tiết hơn về các điều kiện nuôi cấy theo mẻ chất bổ sung của B. bifidum được liệt kê trong bảng 2.
| Nội dung | Cài đặt vi lưu | |
|---|---|---|
| Reservoir a (chất bổ sung) | 500 g/L glucose |
|
| Reservoir b (kiểm soát độ pH) | 3M NaOH |
|
| Giếng canh tác | B. bifidum trong môi trường MRS |
|
Bảng 2. Điều kiện nuôi cấy theo mẻ cho B. bifidum
Thiết lập bố trí trong đĩa giếng tròn vi lưu NextGen
Tất cả các quá trình nuôi cấy theo mẻ đều diễn ra trong Đĩa tròn vi lưu NextGen (Hình 2).
Hàng A chứa 1.900 µL dung dịch nạp glucose và hàng B được đổ đầy 1.900 µL chất điều chỉnh pH. Trong phần mềm BioLector, thể tích bơm được điều chỉnh thành 0,30 µL đối với dung dịch nước (NaOH 3 M) và thành 0,16 µL đối với dung dịch nạp có độ nhớt cao hơn (glucose 500 g/L). Trong tất cả các thí nghiệm fedbatch, quá trình nạp được kích hoạt theo thời gian và hồ sơ nạp được đặt thành cấp không đổi với 4 µL/h. Kiểm soát pH được đặt thành pH 6,0. Các điều kiện kỵ khí trong suốt quá trình nuôi cấy trong Đĩa giếng tròn vi lưu NextGen đạt được bằng cách sử dụng nắp khí hóa vi sinh BioLector XT, được gắn vào MTP sau khi đã chuẩn bị và niêm phong bằng lá silicon vô trùng thấm khí (F-GPRSMF32-1).
Kết quả
Nuôi cấy từng mẻ Lactobacillus casei với hệ thống nuôi cấy vi sinh BioLector XT
Trong Hình 3, quá trình nuôi cấy Lactobacillus casei trong môi trường nuôi cấy MRS được thể hiện. Trong đồ thị trên, các tín hiệu trực tuyến của sinh khối và tín hiệu oxy hòa tan (DO) và thể tích chất bổ sung (500 g/L glucose) được trình bày. Trong đồ thị dưới, các giá trị trực tuyến của pH và thể tích liên quan của NaOH được biểu thị theo thời gian nuôi cấy.
Tại đây, ba thiết lập quy trình khác nhau đã được áp dụng: nuôi cấy theo mẻ và hai nuôi cấy theo mẻ chất bổ sung. Một nuôi cấy bắt đầu cấp liệu sau 7,5 giờ và một nuôi cấy bắt đầu cấp liệu sau 10 giờ. Với lưu lượng liên tục là 30 mL/phút N2, DO giảm đều đặn. Sau 45 phút, DO đạt dưới 5% và tiếp tục giảm. Sau 4,5 giờ, DO đạt dưới 0,5% và tiếp tục giảm xuống 0%. Khi bắt đầu pha tĩnh của nuôi cấy vào khoảng 6,7 giờ, sự tăng trưởng theo cấp số nhân dừng lại và tín hiệu sinh khối là 42 au trong cả ba phương pháp nuôi cấy tại thời điểm này. Nuôi cấy theo mẻ tiếp tục phát triển chậm hơn nữa đến mức tối đa là 44 au sau 9,5 giờ, sau đó giảm dần xuống tín hiệu sinh khối cuối cùng là 38 au khi kết thúc quá trình nuôi cấy. Sự gia tăng tín hiệu sinh khối có tương quan với việc bổ sung nguồn dinh dưỡng. Ngay khi bắt đầu cấp liệu, tín hiệu sinh khối tăng lên có thể nhìn thấy. Tín hiệu sinh khối cuối cùng cho quy trình 7,5 giờ-fed-batch là 76,3 au và cho quy trình 10 giờ-fed-batch, nó dẫn đến tín hiệu sinh khối cuối cùng là 65,5 au sau 30 giờ. Các giá trị cho dung dịch bazơ được thêm vào có tương quan với sự tăng trưởng. Việc bổ sung NaOH 3 M đã được dừng lại khi bắt đầu pha tĩnh vì không có quá trình sản xuất axit của vi khuẩn nào diễn ra nữa do không có sự tăng trưởng. Trong trường hợp bổ sung nguồn dinh dưỡng liên tục, quá trình sản xuất axit vẫn tiếp tục và do đó, cần thêm bazơ để duy trì giá trị điểm đặt pH là pH 6,0.
Tóm lại, thí nghiệm này cho thấy rằng lò phản ứng sinh học BioLector XT là thiết bị phù hợp cho nuôi cấy kỵ khí nhờ nắp thoát khí và ứng dụng thành công việc kiểm soát độ pH và cho ăn cùng lúc với quá trình thoát khí kỵ khí trực tiếp.
Xác nhận kỹ thuật và sinh học về các điều kiện kỵ khí trong thiết bị nuôi cấy vi sinh BioLector XT
Duy trì điều kiện kỵ khí trong suốt thời gian nuôi cấy là một yêu cầu quan trọng trong trường hợp nuôi cấy các sinh vật nhạy cảm với oxy. Trong thí nghiệm sau, một cảm biến oxy bên ngoài (FTM Pst6 Sensor/Fibox 4 trace, PreSens Precision Sensing GmbH, Đức) đã được lắp đặt tại đầu ra khí của its để xác nhận chức năng kỹ thuật của nắp khí sinh học vi sinh BioLector XT và để chứng minh độ kín của nắp khí sinh học và do đó, điều kiện kỵ khí.
Trong Hình 4, dữ liệu thực nghiệm của một đợt nuôi cấy Lactobacillus plantarum (L. plantarum) được hiển thị. Trong đồ thị trên, tín hiệu sinh khối trực tuyến được hiển thị (tăng 3) và trong đồ thị dưới, tín hiệu trực tuyến của oxy hòa tan trong môi trường nuôi cấy và nồng độ oxy trong đầu ra khí của lò phản ứng vi sinh BioLector XT, tín hiệu pH trực tuyến cũng như thể tích NaOH được thêm vào để kiểm soát pH được hiển thị.
Sau thời gian trễ là 2,86 giờ, sự tăng trưởng theo cấp số nhân bắt đầu. Tín hiệu sinh khối cuối cùng là 155,865 au (OD 600 = 9,01 ± 0,07) sau 7,96 giờ khi pha tĩnh bắt đầu. Trong quá trình tăng trưởng của L. plantarum, quá trình sản xuất axit lactic diễn ra. Sự tăng trưởng hình thành axit đó có liên quan đến thể tích NaOH được thêm vào để duy trì pH 6. Với lưu lượng liên tục là 30 mL/phút N2, DO giảm đều đặn.
Sau 39 phút, DO đạt dưới 5% và tiếp tục giảm. Sau 4 giờ, DO giảm xuống dưới 0,5% và tiếp tục giảm xuống 0%. Cảm biến bên ngoài cho thấy nồng độ oxy cuối cùng là 0,029% sau thời gian nuôi cấy là 16 giờ.
Với ví dụ nuôi cấy này, chức năng kỹ thuật đã được xác thực, nhưng thực tế là Lactobacillus spp. cũng có thể phát triển trong điều kiện hiếu khí và thậm chí có thể chuyển hóa oxy không phải là bằng chứng đủ để xác nhận sinh học về nuôi cấy kỵ khí trong BioLector XT. Do đó, Bifidobacterium bifidum kỵ khí bắt buộc đã được nuôi cấy. Việc nuôi cấy thành công chủng này đóng vai trò là xác nhận sinh học cho nuôi cấy kỵ khí trong BioLector XT. Hình 5 biểu thị dữ liệu thực nghiệm của một mẻ cũng như nuôi cấy theo mẻ bổ sung của B. bifidum. Ở đồ thị trên, các tín hiệu trực tuyến của sinh khối và thể tích chất bổ sung được biểu diễn theo thời gian nuôi cấy. Ở đồ thị dưới, tín hiệu trực tuyến (optodes) của pH và DO, cũng như thể tích bổ sung của NaOH 3M và tín hiệu oxy của cảm biến khí bên ngoài ở đầu ra khí của BioLector XT, được trình bày.
Sau thời gian trễ 2,4 giờ, sự tăng trưởng theo cấp số nhân bắt đầu và đối với nuôi cấy theo mẻ, tín hiệu sinh khối đạt giá trị cuối cùng là 147,57 au (OD600 = 8,3 ± 0,57). Ngược lại với nuôi cấy theo mẻ, có thể quan sát thấy pha tăng trưởng theo cấp số nhân kéo dài. Hiện tượng này là do lượng glucose cao hơn trong môi trường vì thức ăn đã bắt đầu sau 6 giờ. Sau 23 giờ nuôi cấy, giá trị sinh khối tối đa là 227,3 au (OD600 = 15,93 ± 0,69) đã đạt được. Trong quá trình phát triển của B. bifidum, sản xuất axit lactic đã xảy ra và sự phát triển của nó tương quan, có thể quan sát thấy trong đường bổ sung NaOH để duy trì độ pH ở pH 6. Tổng cộng, 193,56 µL NaOH 3 M đã được bơm vào môi trường nuôi cấy. Với lưu lượng liên tục là 30 mL/phút N2, DO giảm đều đặn. Dữ liệu oxy bên ngoài đã được mô tả trong 16 giờ đầu tiên kể từ khi nuôi cấy L. plantarum (như đã mô tả trước đó) và B. bifidum đã được thu thập đồng thời trong cùng một lần chạy hệ thống nuôi cấy vi sinh BioLector XT và do đó, cùng một MTP, nắp cấp khí và cảm biến khí bên ngoài đã được sử dụng. Có thể quan sát thấy tín hiệu DO tăng nhẹ từ 18 giờ, điều này có thể được giải thích bằng độ lệch tín hiệu có điều kiện kỹ thuật của các cực quang oxy với độ lệch ở 0% oxy là < 0,5% O2 mỗi ngày. Dữ liệu của cảm biến oxy bên ngoài cho thấy giá trị 0,029% oxy trong khí đầu ra của hệ thống nuôi cấy vi sinh BioLector XT sau 23 giờ, xác nhận rằng các điều kiện nuôi cấy kỵ khí được duy trì trong toàn bộ thời gian nuôi cấy. Tóm lại, Beckman Coulter trình bày một thí nghiệm nuôi cấy thành công một sinh vật kỵ khí trong hệ thống nuôi cấy vi sinh BioLector XT . Kết hợp với công nghệ chip vi lưu m2p-labs và phương pháp cung cấp khí nitơ trực tiếp qua nắp cung cấp khí, hiệu suất đồng thời của việc kiểm soát độ pH, cung cấp thức ăn và cung cấp khí nitơ trực tiếp không còn là thách thức trong nuôi cấy quy mô nhỏ
Phần kết luận
Beckman Coulter đã trình bày xác nhận về mặt kỹ thuật và sinh học của việc nuôi cấy các vi khuẩn probiotic như Lactobacillus spp. và Bifidobacterium bifidum với hệ thống nuôi cấy vi sinh BioLector XT kết hợp với nắp cấp khí kỵ khí. Công nghệ chip vi lưu m2p-labs kết hợp với khí hóa nitơ trực tiếp của MTP thông qua nắp khí hóa cho phép thực hiện đồng thời việc kiểm soát độ pH, chất bổ sung và khí hóa nitơ trực tiếp trong các hệ thống nuôi cấy quy mô nhỏ. Đây là một hệ thống phù hợp để nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí.
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các Thiết bị nuôi cấy vi sinh hãng Beckman Coulter.
EN