Giới thiệu
Các kỹ thuật sinh học hiện đại đã cho phép các nhà khoa học khám phá tiềm năng của vi tảo trong việc sản xuất năng lượng và các hợp chất có giá trị. Sự gia tăng gần đây về mối quan tâm đến công nghệ sinh học tảo đã dẫn đến những tiến bộ đáng kể trong việc sử dụng vi tảo để sản xuất nhiên liệu sinh học, cô lập carbon dioxide và phục hồi sinh học môi trường, đồng thời cho thấy tiềm năng to lớn của tảo như một nguồn sinh khối, thực phẩm, dược phẩm chức năng và dược phẩm.
Hơn nữa, việc sử dụng tảo làm nhà máy sản xuất tế bào vi khuẩn cung cấp câu trả lời cho một số thách thức toàn cầu cấp bách nhất như khủng hoảng lương thực và năng lượng và sẽ thúc đẩy quá trình chuyển đổi sang nền kinh tế sinh học bền vững. Chuỗi giá trị vi tảo có khả năng sinh lời và cạnh tranh ở quy mô công nghiệp, nhưng các nhà máy lọc sinh học cần được điều chỉnh theo tiềm năng sinh học, lộ trình xử lý và nhu cầu thị trường.
Các điều kiện nuôi cấy được cải thiện, sàng lọc chủng loại và kỹ thuật chủng loại là những bước quan trọng để thương mại hóa, ví dụ bằng cách tối đa hóa hiệu suất chuyển đổi năng lượng mặt trời thành sản phẩm bằng cách cắt bớt kích thước ăng-ten diệp lục. Các thiết bị nuôi cấy dựa trên microwell cung cấp một công cụ mạnh mẽ để sàng lọc nhanh chóng và ở giai đoạn đầu đối với các tế bào vi khuẩn và động vật có vú và đã được sử dụng để phát triển quy trình sinh học tảo dị dưỡng
Hệ thống vi phản ứng quang sinh học (μPBR) là cần thiết để nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy tự dưỡng hoặc hỗn hợp tối ưu, nhưng các khái niệm hiện tại còn lâu mới đạt đến công nghệ hàng loạt và việc cải tiến hơn nữa – đặc biệt là về độ chiếu sáng có thể điều chỉnh – là điều cần thiết.
Đối với Ghi chú ứng dụng này, Hệ thống nuôi cấy vi sinh BioLector XT được trang bị một mô-đun chiếu sáng tinh vi để cho phép nuôi cấy song song, quang dưỡng trong tối đa 48 giếng vi mô và các mô-đun bộ lọc chuyên dụng được thiết kế để cho phép đo trực tuyến, không xâm lấn các thông số nuôi cấy quan trọng như sinh khối, nồng độ diệp lục và độ pH. Mô-đun chiếu sáng hoặc Mô-đun mảng ánh sáng (LAM) cho phép chế độ chiếu sáng chính xác và đa dạng trong quang phổ quang hợp có liên quan. Tính linh hoạt của quang phổ đạt được nhờ tổng cộng 16 loại đèn LED khác nhau, mỗi loại có thể được điều khiển riêng lẻ, cung cấp độ rọi tối đa gần 4000 μmol/m2/giây.
Chlorella vulgaris có thể phát triển quang dưỡng, dị dưỡng và hỗn dưỡng và là một trong những chi tảo chiếm ưu thế trên thị trường, với khoảng 5000 tấn sinh khối được sản xuất mỗi năm. Chlorella vulgaris cho thấy tốc độ tăng trưởng cao trong điều kiện nuôi cấy đa dạng và nhiều nghiên cứu đã chỉ ra nhiều ứng dụng cho các thành phần sinh hóa do Chlorella vulgaris sản xuất . Hàm lượng protein cao của nó – với cấu hình axit amin so sánh tốt với các giá trị do Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đề xuất đối với dinh dưỡng của con người – cùng với sự hiện diện của các chất dinh dưỡng thiết yếu đã dẫn đến nhiều ứng dụng khác nhau trong ngành thực phẩm và thức ăn chăn nuôi . Hơn nữa, sự tích tụ của axit béo C16 và C18 trong điều kiện tăng trưởng bất lợi mang đến khả năng sản xuất nhiên liệu sinh học trong các nhà máy xử lý nước thải.
Trong AppNote này, Beckman Coulter trình bày rằng Hệ thống nuôi cấy vi sinh BioLector XT – được trang bị LAM – phù hợp cho việc nuôi cấy quang tự dưỡng của C. vulgaris. Hơn nữa, một số mô-đun bộ lọc đã được thiết kế và xác nhận để theo dõi các thông số nuôi cấy quan trọng trực tuyến.
Phương pháp
Phát triển các mô-đun lọc
Một số mô-đun lọc đã được thiết kế và thử nghiệm để theo dõi trực tuyến các thông số quan trọng của quá trình canh tác quang hợp.
Sinh khối: Để xác định sinh khối bằng ánh sáng tán xạ, các mô-đun lọc được phát triển bên ngoài phổ hấp thụ diệp lục (>700 nm) để tránh sự can thiệp của sắc tố. Các mô-đun lọc này được hiệu chuẩn theo một loạt pha loãng của Chlorella vulgaris.
Hàm lượng diệp lục: Huỳnh quang diệp lục được sử dụng để định lượng nồng độ diệp lục trực tuyến. Để đạt được mục đích đó, các tiêu chuẩn diệp lục a và b (Sigma-Aldrich) được hòa tan trong DMSO và một số mô-đun lọc đã được thử nghiệm với chuỗi pha loãng diệp lục a và b. Hơn nữa, hiệu chuẩn huỳnh quang diệp lục so với sinh khối đã được thực hiện.
pH: Không thể sử dụng phép đo pH bằng optodes trong điều kiện chiếu sáng liên tục do optodes dễ bị tẩy màu quang. Một giải pháp thay thế là chất chỉ thị pH huỳnh quang hòa tan 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt (HPTS) có thể được sử dụng để xác định pH quang học. Đối với phương pháp này, hai mô-đun đã được thiết kế cần được lắp đặt đồng thời do bản chất tỷ lệ của phép xác định pH thông qua HPTS.
Ở bước sóng phát xạ 520 nm, HPTS có cường độ huỳnh quang phụ thuộc pH ở bước sóng kích thích lần lượt là 405 và 455 nm. Tỷ lệ cường độ I R (Phương trình 1) ổn định trong phạm vi pH từ 0 đến 14 21 nhưng không thể tính giá trị pH mà không có hiệu chuẩn trước. Việc khớp kết quả hiệu chuẩn với phương trình Boltzmann cho phép tính toán các thông số hiệu chuẩn pH 0 , dpH, I R,min và I R,max (Phương trình 2).
Với các mô-đun lọc được thiết kế, các đường cong hiệu chuẩn đã được tạo ra để đánh giá tiềm năng xác định pH thông qua HPTS trongHệ thống nuôi cấy vi sinh BioLector XT. Hơn nữa, khả năng nhạy cảm của phương pháp này đối với hiện tượng tẩy trắng quang học đã được thử nghiệm trong các điều kiện nuôi cấy quang dưỡng điển hình.
Tảo lục Chlorella
Axenic Chlorella vulgaris được lấy từ Bộ sưu tập nuôi cấy tảo tại Đại học Göttingen (Chủng SAG số 211-11b).
Môi trường nuôi cấy
Các môi trường được nuôi cấy trong công thức thích hợp của môi trường cơ bản Bold giàu dinh dưỡng (enBBM), ở giá trị pH là 6,5
Môi trường bao gồm đệm MES 9,76 g/L, NaNO 3 1,5 g/L , 0,6 g/LK 2 HPO 4 , 1,4 g/L KH 2 PO 4 , 187,5 mg/L MgSO 4 · 7 H2O, 6,25 mg/L NaCl, 125 mg/L CaCl 2 · 2 H 2 O, 9,96 mg/L FeSO 4 · 7 H 2 O, 3,68 H 2 SO 4 , 100 mg/L Na 2 EDTA · 2 H 2 O, 62 mg/L KOH, 10 mg/L natri penicillin-G và dung dịch nguyên tố vi lượng 20 mL/L.
Dung dịch nguyên tố vi lượng có thành phần như sau: 17,64 mg/L ZnSO4 · 7 H2O, 2,88 mg/L MnCl 2 · 4 H2O, 2,4 mg/L Na2MoO 4 · 2 H2O, 3,14 mg/L CuSO4 · 5 H2O, 0,94 mg/L CoSO4 · 7 H2O và 22,8 mg/LH3BO3 .
Đối với nuôi cấy trongHệ thống nuôi cấy vi sinh BioLector XT, dung dịch gốc HPTS được thêm vào môi trường với nồng độ cuối cùng là 0,1 mg/L HPTS.
Nuôi cấy trong bình lắc
Tiền nuôi cấy được nuôi cấy trong bình lắc trong máy ấp ở 25 °C với tốc độ 180 vòng/phút với đường kính lắc là 50 mm. Để cho phép phát triển quang dưỡng, một mô-đun LED được lắp vào một trong các mặt của buồng ủ và các nắp bông được sử dụng để cho phép chuyển khí vào và ra khỏi môi trường nuôi cấy. Mô-đun LED giữ tám dải LED giống như mặt trời (LUMITRONIX LED-Technik GmbH) song song. Độ rọi được đặt ở mức 200 μmol/m2/giây để phù hợp với độ rọi trong quá trình nuôi cấy trong Hệ thống nuôi cấy vi sinh BioLector XT.
Nuôi cấy trong Hệ thống nuôi cấy vi sinh BioLector XT
Nuôi cấy quang dưỡng được thực hiện trong các đĩa vi mô Flowerplate (M2P-MTP-48-B, m2p-labs với nồng độ tế bào ban đầu là 5,5*10^6 tế bào/mL và thể tích làm đầy là 1 mL. Đĩa vi mô được niêm phong bằng tấm niêm phong hút khí (MTP-F-GPRS-48-10) để cho phép trao đổi carbon dioxide và oxy trong quá trình quang hợp. Mô-đun chiếu sáng được thiết lập để cung cấp quang phổ giống như mặt trời từ 400 đến 700 nm ở mật độ thông lượng photon khoảng 200 μmol/m 2 /s (Hình 3).
Các thông số nuôi cấy được thiết lập ở mức 800 vòng/phút, 25 °C và độ ẩm tương đối 85% và quá trình sục khí được thực hiện ở tốc độ dòng chảy 10 mL/phút với hỗn hợp không khí và 2% CO2 .
Kết quả
Hiệu chuẩn các mô-đun lọc
Sinh khối: Các bộ lọc sinh khối được phát triển ở 730, 750 và 850 nm cho thấy kết quả hiệu chuẩn tuyệt vời trong phạm vi 0,3 ≤ OD750 ≤ 25, như được chứng minh trong Hình 3 đối với mô-đun 730 nm. Hơn nữa, không phát hiện thấy sự can thiệp của diệp lục so với các tiêu chuẩn diệp lục a và b.
Hàm lượng diệp lục: Kết quả hiệu chuẩn diệp lục cho thấy các mô-đun lọc được thiết kế cho phép phát hiện riêng biệt và đồng thời diệp lục a và b (Hình 5).
Huỳnh quang diệp lục thường được sử dụng để xác định sinh khối cho các nuôi cấy quang dưỡng. Theo đó, hiệu chuẩn bằng chuỗi sinh khối pha loãng đã được thực hiện và độ phân giải tuyệt vời ở nồng độ sinh khối thấp đã được quan sát thấy khi áp dụng phép điều chỉnh giảm theo cấp số nhân (Hình 6).
Kết quả hiệu chuẩn xác nhận tính ứng dụng của bộ lọc huỳnh quang diệp lục để xác định chính xác nồng độ sinh khối, đặc biệt là ở nồng độ sinh khối thấp.
pH: Các mô-đun lọc pH được hiệu chuẩn ở 25, 30, 35 và 40 °C với dung dịch đệm từ pH 5 đến 10 (Merck, Darmstadt, DE), chứa 0,1 mg/L HPTS. Kết quả hiệu chuẩn tối ưu (Hình 7) xác nhận rằng thiết lập được đề xuất có thể được sử dụng để xác định pH trực tuyến chính xác.
Để đảm bảo phương pháp đề xuất không nhạy cảm với hiện tượng tẩy trắng bằng ánh sáng, một thí nghiệm đã được tiến hành trong lò phản ứng vi sinh BioLector XT trong điều kiện nuôi cấy thông thường ở mức 200 μmol/m2/giây trong enBBM mà không có chất cấy (Hình 8).
Nồng độ CO2 tăng nhanh làm axit hóa môi trường (~0,05 pH) khi bắt đầu thí nghiệm, nhưng sau đó các giá trị đo được vẫn không đổi trong ít nhất 130 giờ (Hình 8). Điều này chứng minh rằng có thể xác định pH chính xác và ổn định trong nhiều ngày trong điều kiện nuôi cấy và đặc biệt là dưới ánh sáng liên tục bằng HPTS.
Nuôi cấy quang dưỡng song song trong lò phản ứng vi sinh BioLector XT
Tiếp theo, quá trình nuôi cấy dài hạn được bắt đầu và theo dõi trực tuyến bằng bốn mô-đun lọc được trình bày: mô-đun ánh sáng tán xạ ở 730 nm, mô-đun lọc huỳnh quang diệp lục (λex = 450 nm; λem = 700 nm) và cả hai mô-đun lọc HPTS để xác định pH theo tỷ lệ (Hình 9).
Hình 9 cho thấy nồng độ sinh khối liên tục tăng trong khoảng 16 ngày cho đến khi nguồn cung cấp CO2 bị ngắt. Có năm pha tăng trưởng riêng biệt: bắt đầu bằng pha tăng trưởng trễ và theo cấp số nhân (I.), tiếp theo là ba tốc độ tăng trưởng tuyến tính riêng biệt (II. đến IV.) và pha (V.) sau khi cạn kiệt CO2. Quá trình tín hiệu pH và diệp lục tương quan với các pha tăng trưởng được quan sát. Hệ số biến thiên trung bình của tín hiệu ánh sáng phân tán trong suốt quá trình thí nghiệm là 5,2%, cho phép nuôi cấy quang dưỡng song song trong thiết lập được đề xuất. Các mẫu ngoại tuyến đã xác nhận độ chính xác của các tín hiệu trực tuyến. Lấy mẫu sau 235 giờ – khi thấy độ pH tăng do tiếp xúc ngắn với nồng độ CO2 trong khí quyển – dẫn đến giá trị OD750 ngoại tuyến là 40 và độ pH ngoại tuyến là 7,3, tương quan tốt với độ pH xác định trực tuyến là 7,2. Vào cuối thí nghiệm, giá trị OD750 ngoại tuyến vào khoảng 60, cho thấy sự tăng trưởng mạnh trong quá trình thí nghiệm, dẫn đến nồng độ sinh khối cao.
Phần kết luận
Việc bổ sung Light Array Module đã mở ra một hướng đi mới cho các thiết bị BioLector. Ghi chú ứng dụng này trình bày một số mô-đun lọc có thể theo dõi chính xác các thông số quan trọng của quá trình nuôi cấy quang dưỡng như nồng độ sinh khối, hàm lượng diệp lục và độ pH.
Độ phân giải vượt trội để xác định sinh khối ở nồng độ thấp khi sử dụng mô-đun lọc huỳnh quang diệp lục bổ sung cho phép đo ánh sáng tán xạ chính xác nhất ở mật độ tế bào đủ cao. Hơn nữa, phép xác định pH dựa trên HPTS đã chứng tỏ là một giải pháp thay thế tối ưu cho phép đo quang điện, ngay cả khi chiếu sáng liên tục.
Việc nuôi cấy dài hạn với Chlorella vulgaris đã khẳng định tiềm năng của hệ thống như một lò phản ứng quang sinh học song song, thông lượng cao ở quy mô microlit. Hơn nữa, các mô-đun lọc được phát triển đã cung cấp thông tin trực tuyến về sự phát triển của các nền văn hóa và tiết lộ một số giai đoạn phát triển riêng biệt. Những kết quả này cung cấp một nền tảng có thể được sử dụng để tối ưu hóa các nền văn hóa quang dưỡng theo nhiều cách và cho nhiều ứng dụng. Thiết kế của mô-đun chiếu sáng cho phép thiết lập một phạm vi quang phổ và độ rọi rộng trong các chế độ chiếu sáng khác nhau, có thể được sử dụng để tìm ra các điều kiện chiếu sáng tối ưu. Những đặc điểm chiếu sáng này đã được báo cáo rộng rãi là ảnh hưởng đến sự phát triển của tảo.
Tốc độ dòng khí và thành phần khí có thể được sử dụng để thay đổi bầu không khí của thí nghiệm trong Hệ thống nuôi cấy vi sinh BioLector XT, đây là một thông số quan trọng trong nuôi cấy quang dưỡng vì, ví dụ, lượng khí CO2 lớn dẫn đến nồng độ sinh khối cao hơn. Các yếu tố quan trọng khác ảnh hưởng đến nuôi cấy tảo siêu nhỏ là nhiệt độ, pH, độ mặn, nguồn carbon, nguồn nitơ và thành phần môi trường. Hệ thống BioLector XT cho phép tối ưu hóa tất cả các thông số này.
Hơn nữa, phương pháp nuôi cấy theo mẻ đã được đề xuất để cải thiện năng suất lipid. Tiềm năng của các chủng tảo biến đổi gen chỉ được nghiên cứu và ứng dụng một cách hạn chế do những hạn chế về quy định, nhưng có thể dẫn đến tốc độ tăng trưởng và mật độ tế bào cao hơn, tốc độ sản xuất hoặc nồng độ tăng, độ bền được cải thiện hoặc hiệu suất chuyển đổi năng lượng mặt trời thành sinh khối cao hơn và năng suất quang hợp
Tất cả các yếu tố này có thể được nghiên cứu và tối ưu hóa bằng cách kết hợp giữa lò phản ứng sinh học BioLector XT và LAM, đẩy nhanh quá trình nghiên cứu để đưa ra câu trả lời cần thiết giúp hiện thực hóa tiềm năng của tảo.
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các Thiết bị nuôi cấy vi sinh hãng Beckman Coulter.
EN