Nguyên tắc cốt lõi của quá trình cố định mô và xử lý mô

Phẫu tích

Bao gồm:

• Mô tả chi tiết về mẫu, bao gồm kích thước, hình dạng, màu sắc và tính nhất quán
• Đánh dấu đặc biệt nếu cần xác định các cạnh (margins).
• Lựa chọn mẫu đại diện cho quá trình phân tích
• Cắt mẫu đến kích thước tối ưu cho việc xử lý:
  • Dày 1-2 mm cho quy trình xử lý ngắn hạn.
  • Dày 3-5 mm cho quy trình xử lý thông thường qua đêm.

Cassettes tiêu chuẩn

Cassettes chuyên biệt

Cassettes lưới kim loại

Cassettes lưới kim loại thường được sử dụng cho các mẫu sinh thiết nhằm tránh sử dụng các miếng đệm hoặc bọc sinh thiết.

Việc đóng không đúng cách các khuôn mẫu có thể gây ra tình trạng bí không khí, điều này sẽ làm cho mô bị mắc kẹt và dẫn đến quá trình xử lý kém!

Sử dụng cassette phù hợp

Sử dụng cassette kém

Xử lý mô

Quá trình khử nước khỏi các mô cố định hoàn toàn và thay thế bằng sáp để chuẩn bị lam kính hoặc các nghiên cứu phụ trợ khác để bảo tồn tính toàn vẹn của mẫu, đảm bảo rằng các mẫu thu được đáng tin cậy cho việc chẩn đoán và các xét nghiệm hỗ trợ.

Xử lý mô với xylene

• Mô đã được cố định bằng các chất cố định có hàm lượng nước cao. Quá trình loại bỏ nước “tự do” này, cùng với mạng lưới protein, được gọi là khử nước.
• Quá trình khử nước thông thường đối với các mẫu mô được nhúng paraffin, sử dụng một loạt các nồng độ ethanol hoặc cồn tăng dần.
• Rượu: Dần dần thay thế nước, giảm thiểu sự co rút và biến dạng của các yếu tố mô.
• Lý tưởng: 3-4% nước sẽ còn lại trong mô để đảm bảo việc cắt lát tốt.

Nồng độ cồn khuyến nghị

• Nồng độ cồn đầu tiên sau formalin phải là 70% hoặc thấp hơn để tránh hình thành tinh thể formalin
• Tỷ lệ phần trăm điển hình tăng dần qua 70%, 80%, 95% đến ba lần thay đổi là 100%.

Thông tin khác về cồn

• Nồng độ 70% trở xuống sẽ ngăn ngừa tinh thể và giảm khả năng gây sốc hoặc thiệt hại mô
• Thời gian kéo dài ở nồng độ cao hơn (100%) có thể gây ra tình trạng cứng và giòn (khử nước quá mức)
• Thêm Eosin, Toluidine Blue hoặc các chất tạo màu khác vào cồn để tạo màu nhẹ là tốt với lượng nhỏ.

Khử nước quá mức

• Mất nước liên kết (3-4% nên được giữ lại)
• Cấu trúc phân tử phá vỡ làm tăng mật độ, dẫn đến khó khăn trong việc cắt mẫu.
• Mẫu trở nên rất khô, giòn và cứng.
• Ngâm trong nước cho phép mô “hút” độ ẩm, làm cho những lát tiếp theo không bị khô như trước, nhưng nếu ngâm quá lâu có thể tạo ra hiện tượng dị dạng trong mô.

Ngâm nước quá mức

Trong hình ảnh này, chúng ta thấy nhân nhạt và sưng ở ruột kết bình thường. Việc mất chi tiết nhân có thể cản trở chẩn đoán các khối u ác tính biệt hóa tốt.

Rửa mô

• Bước trung gian giữa quá trình khử nước và thẩm thấu paraffin
• Mục đích là loại bỏ cồn và thay thế bằng một chất lỏng có thể hòa tan với paraffin
• Tại sao gọi là “Rửa mô”?
  • Khi các chất làm sạch thâm nhập vào mô, chúng khiến chúng trở nên trong suốt và cứng, đồng thời thay thế cồn
  • Khi tất cả các khoảng trống trong mô được lấp đầy bằng dung dịch “rửa mô”, mô trở nên đồng nhất về mặt quang học và trong suốt

Chất rửa mô

Chất rửa mô chất lượng cho phép thâm nhập vào mô nhanh chóng, không làm cứng mô quá mức và tương thích tốt với paraffin

Xylene

• Ưu điểm:
  • Nhanh chóng thay thế cồn ra khỏi mô
  • Làm cho mô trở nên trong suốt
  • Dễ xử lý hơn đối với mô bị mất nước chưa hoàn toàn
  • Chi phí thấp
• Nhược điểm:
  • Dễ cháy và độc hại
  • Tiếp xúc lâu dài có thể làm cho mô trở nên cứng và giòn, gây khó khăn trong quá trình cắt

Các chất rửa mô khác

• Benzene – hoạt động tốt nhưng rất độc hại, dễ cháy và gây ung thư
• Toluene – thâm nhập chậm nhưng gây ít cứng hơn
• Chloroform
• Cedarwood oil (dầu gỗ tuyết tùng)
• Methyl Salicylate (methyl salicylat)

Xử lý mô nhiệt

• Ưu điểm:
  • Không gây ảnh hưởng xấu đến các nhuộm đặc biệt
  • Các kháng nguyên thường được bảo quản tốt hơn
  • Thời gian xử lý mẫu nhanh chóng
  • Tốc độ thẩm thấu của chất cố định nhanh hơn
• Nhược điểm:
  • Nhiệt độ phải nằm trong khoảng chấp nhận được (70-85°C), cần giám sát chặt chẽ vi sóng để tránh việc lệch tần số của magnetron
  • Có thể xảy ra hiện tượng tạo không bào và thay đổi nhiễm sắc thể
  • Kích thước mẫu bị giới hạn, không lớn hơn 3mm
  • Mẫu vẫn phải được gửi đến phòng thí nghiệm trong formalin để ngăn chặn quá trình tự tiêu

Paraffin

• Ưu điểm:
  • Tan chảy nhanh chóng
  • Thấm vào mô ở dạng lỏng
  • Nhanh chóng đông đặc khi làm mát
  • Có thể sử dụng an toàn ở nhiệt độ cao (65°C) mà không gây hại cho mô và sẽ cải thiện sự thấm bằng cách giảm độ nhớt
• Nhược điểm:
  • Một số biến dạng mô có thể xảy ra do sự co rút của mô
  • Độ ẩm thấp có thể tạo ra tĩnh điện
  • Việc thấm các khối lớn mất nhiều thời gian
  • Việc cắt lát đòi hỏi các khối phải được làm mát để lấy được các lát mỏng (dưới 5 µm).

Paraffin và polymers

• Có nhiều loại parafin trên thị trường. Một số loại có hàm lượng polyme nhựa khác nhau để tăng thêm khả năng hỗ trợ và dễ dàng cắt lát.
• Lựa chọn tùy thuộc vào bạn và loại nào là tốt nhất cho phòng thí nghiệm cụ thể

Cố định mô

Mục đích cố định mô

1. Để đông kết hoặc kết tủa các chất trong protoplasm, từ đó giúp cho các tế bào và thành phần mô có thể kháng cự với những thay đổi tiếp theo do các tác nhân trong quá trình xử lý.
2. Ngừng quá trình tự phân hủy (autolysis)
3. Ngăn chặn sự phân hủy do vi khuẩn

Tiêu chí lựa chọn chất cố định

1. Để thể hiện hình thái tổng quát, nên sử dụng một chất cố định tổng quát hoặc thông thường.
2. Nếu cần thể hiện các loại tế bào cụ thể hoặc thành phần tế bào, nên sử dụng các chất cố định đặc biệt để bảo tồn các cấu trúc này một cách chính xác.
3. Lựa chọn chất cố định phải tương thích với các bước nhuộm sau này hoặc các xét nghiệm hỗ trợ khác.

Đặc điểm của chất cố định tốt

1. Thâm nhập nhanh vào mô để ngăn ngừa các thay đổi sau khi mô chết ảnh hưởng đến cấu trúc và hình thái.
2. Cố định và làm cứng mô với sự biến dạng tối thiểu của các tế bào thông qua sự biến tính của nội dung hóa học trong tế bào. a.) Biến tính (Denaturation): Là sự thay đổi trong các tính chất hóa học, vật lý và sinh học của protein do sự thay đổi cấu trúc. b.) Kết quả, các protein thường đông lại, tức là trở nên không tan và các phân tử được ổn định.
3. Cung cấp kết quả có thể lặp lại và nhất quán.

Chất cố định hoạt động như thế nào

• Quá trình cố định bắt đầu từ các cạnh ngoài và tiến vào bên trong. Tốc độ thâm nhập sẽ xác định mức độ thay đổi sau khi mô chết xảy ra ở trung tâm mô trước khi chất cố định đến được vùng này.

Những yêu cầu đối với chất cố định

1. Giảm thiểu sự co lại / biến dạng của mô.
2. Ngăn chặn hoạt động của enzyme và vi khuẩn.
3. Cải thiện tính chất nhuộm.
4. Làm cứng mô để cấu trúc tế bào không bị biến dạng trong các bước xử lý tiếp theo.

Chất cố định mô cơ bản

Formaldehyde

• Là một khí có công thức phân tử là HCHO, được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp hóa học, nhưng rất khó áp dụng cho các tác vụ sinh học, do đó nó được sử dụng bằng cách hòa tan trong nước.
• Hình thành liên kết chéo giữa các protein, giúp ổn định cấu trúc mô.
• Các cấu trúc này cho phép mô chịu được các bước xử lý tiếp theo.
• Thời gian cố định tương đối ngắn.
• Chi tiết hạt nhân và tế bào chất được bảo tồn đầy đủ.
• Là chất cố định phổ biến, đặc biệt cho các mô được vùi paraffin thông thường.
• Để có hiệu quả, mẫu nên được ngâm trong ít nhất 15 đến 20 lần thể tích của nó.
• Chất được sử dụng phổ biến nhất là 10% formalin trung tính đệm.

Formalin

• Nồng độ không hoạt động điển hình là 37% – 40%. Cụ thể, một dung dịch formalin thương mại chứa 370 – 400 g formaldehyde trong mỗi 1000 ml dung dịch thương mại.
• Công thức pha loãng phổ biến nhất (nồng độ hoạt động) là dung dịch 10% formalin trong nước (10 ml formalin 37%, 90 ml nước cất).
• Do tính chất axit của nó, dung dịch này cần được đệm (ví dụ như phosphate natri đơn và phosphate natri kép) đến pH từ 7.0 đến 7.2. Điều này giúp ổn định chất cố định và ngăn chặn sự hình thành axit formic.
• Thời gian cố định formalin:
  • Sinh thiết ruột già (GI0, mẫu vú và tuyến tiền liệt, mảnh da dưới 2 mm, mẫu da với kích thước 2-3 mm được cắt đôi (mỗi mảnh không lớn hơn 1.5 mm), và các mẫu khác như sinh thiết phổi, v.v.: tối thiểu 2-3 giờ cố định.
  • Mẫu da lớn hơn với các mảnh giữa 2 và 3 mm sau khi cắt cho cassette, ống Fallopian, hạch bạch huyết, túi mật, ruột thừa, và các sinh thiết kích thước trung bình khác: tối thiểu 6 giờ cố định.
  • Mẫu dày tới 5 mm: tối thiểu 8 giờ cố định.
  • Các mẫu rất lớn nên được cắt theo hình “bread-loafed” và để cố định qua đêm trước khi chuẩn bị cho thiết bị. Tuân theo thời gian cố định dựa trên kích thước như đã chỉ ra ở trên.

Glutaraldehyde

• Giống như formaldehyde, nó hình thành liên kết chéo giữa các protein.
• Gây biến dạng một số cấu trúc trong protein, làm cho nó không phù hợp cho nhuộm miễn dịch huỳnh quang (IHC).
• Cố định khá nhanh, nhưng thâm nhập kém (các mẫu phải nhỏ).
• Cung cấp chi tiết tốt nhất về tế bào chất và hạt nhân.
• Lý tưởng cho kính hiển vi điện tử.

Alcohols – Ethyl and Methyl

• Cố định xảy ra thông qua sự biến tính protein (một thay đổi cấu trúc trong các phân tử protein do các điều kiện cực đoan) thông qua việc phá vỡ các liên kết kỵ nước, liên kết này đóng vai trò rất quan trọng trong việc ổn định cấu trúc ba chiều của các cấu trúc tiểu phân.
• Ưu điểm: Tốt cho các mẫu tế bào vì chúng hoạt động nhanh chóng và tạo ra chi tiết hạt nhân tốt.
• Nhược điểm: Không được sử dụng thường xuyên cho mô vì chúng gây ra tình trạng giòn và cứng.

Tác nhân oxy hóa

• Tác nhân oxy hóa hiếm khi sử dụng:
• Tác nhân oxy hóa bao gồm: kali permanganat, dichromat và osmium tetroxide.
  • Hình thành liên kết chéo giữa các protein, nhưng gây ra sự biến tính rộng rãi.
  • Được sử dụng cho các ứng dụng chuyên biệt.

Picrates

• Chất Cố Định Có Chứa Axit Picric (Chất Thường Gặp Là Bouin’s)
• Ưu: Cung cấp chi tiết hạt nhân tốt và không gây độ cứng nhiều như các chất cố định chứa thủy ngân.
• Nhược: Axit picric có nguy cơ nổ khi ở dạng khô. Trong dung dịch, nó làm ố mọi thứ mà nó tiếp xúc thành màu vàng.

Thủy Ngân

• Cố định mô bằng một cơ chế chưa được biết đến.
• Chloride thủy ngân (Mercuric Chloride) và bao gồm các chất cố định như B5 và Zenker.
• Ưu điểm:
  • Hầu hết mọi người đều đồng ý rằng chi tiết hạt nhân có độ phân giải cao
  • Là chất cố định được sử dụng rộng rãi nhất cho các mô huyết học và mô liên kết mạng.
• Nhược điểm:
  • Những ý kiến trái chiều về sự thâm nhập thủy ngân
  • Sản xuất ion hydro gây ra sự lắng đọng các tinh thể mercuric trong mô, cần phải được loại bỏ (sử dụng i-ốt Lugol) (xylene-i-ốt).
  • Thủy ngân là chất độc và cần được xử lý cẩn thận (điều này có thể rất tốn kém).
  • Việc sử dụng thủy ngân đã bị cấm (tính từ năm 2006).

Tóm tắt về cố định mô

• Không có chất cố định phổ quát
• Mỗi chất cố định đều có các tính chất và nhược điểm riêng biệt.
• Cần lựa chọn cẩn thận khi các tính chất và chất liệu tế bào cụ thể là mục tiêu.
• 10% formalin trung tính đã được đệm là chất cố định được sử dụng rộng rãi nhất cho bệnh lý phẫu thuật.
• Glutaraldehyde là chất cố định được sử dụng rộng rãi nhất cho kính hiển vi điện tử.

Nguồn: https://www.leicabiosystems.com/knowledge-pathway/fundamentals-of-fixation-and-tissue-processing/