Được viết bởi Thierry Bonnevay (Chuyên gia Phân tích Vi sinh vật, Sanofi) & Laurent Leblanc (Giám đốc R&D, bioMérieux)
Mục đích của bài viết này là cung cấp tổng quan về các quy định và thông lệ hiện hành về ủ mẫu Giám sát môi trường (EM).
Hiện tại, việc ủ mẫu ở hai nhiệt độ là một trong những phương pháp phổ biến nhất trong EM. Tuy nhiên, phương pháp ủ mẫu một nhiệt độ được xác định rõ có thể thay thế chế độ hai nhiệt độ
Trong một thị trường công nghiệp luôn thay đổi và cạnh tranh cao, việc áp dụng phương pháp ủ mẫu một nhiệt độ không chỉ tăng hiệu quả quy trình cho các nhà sản xuất dược phẩm mà còn giảm thiểu rủi ro do các lỗi gây ra bởi các thời gian ủ với hai nhiệt độ
Chúng tôi sẽ thảo luận về những thách thức của việc ủ mẫu với một môi trường / một nhiệt độ và đánh giá tính bền vững của ủ mẫu một nhiệt độ cho EM.
Đánh giá Quy định về Giám sát Môi trường (EM) và Điều kiện Ủ
Không có mô tả chi tiết về điều kiện giám sát môi trường (EM) và ủ trong các Dược điển, cũng như trong các hướng dẫn chính thức. Cũng không có yêu cầu bắt buộc nào, ngoại trừ mô tả chung trong Chương <1116> của Dược điển Hoa Kỳ (USP), Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA), và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO). Phụ lục 1 là tài liệu duy nhất mô tả các yêu cầu cho việc đánh giá rủi ro thông qua việc đề xuất chiến lược kiểm soát ô nhiễm. Tuy nhiên, không có sự đồng thuận thực sự hoặc mô tả chính thức về phương pháp hoặc điều kiện ủ tối ưu cho nhiệt độ và thời gian EM so với kiểm tra mức độ ô nhiễm vi sinh.
Hướng dẫn của FDA dành cho Ngành công nghiệp: Sản phẩm Dược vô trùng Sản xuất bằng Quy trình Vô trùng – Thực hành Sản xuất Tốt Hiện tại (2004) mô tả rằng: “Các môi trường nuôi cấy vi sinh được sử dụng trong giám sát môi trường (EM) nên được xác nhận là có khả năng phát hiện nấm (tức là nấm men và nấm mốc) cũng như vi khuẩn và được ủ ở các điều kiện thời gian và nhiệt độ phù hợp.”
“Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí có thể được thực hiện bằng cách ủ ở 30–35°C trong 48–72 giờ. • Đếm tổng số nấm men và nấm mốc kết hợp thường có thể được thực hiện bằng cách ủ ở 20–25°C trong năm đến bảy ngày.”
Tổ chức Y tế Thế giới (WHO): Giám sát Môi trường trong Các Cơ sở Sản xuất Vaccine (2012) đề cập rằng: “Mẫu giám sát môi trường nên được ủ ở ít nhất hai nhiệt độ để phát hiện cả vi khuẩn và nấm. Trong thực tế, việc sử dụng ba đến năm ngày ủ ở 20–25°C sau đó ủ ở 30–35°C trong thêm hai đến ba ngày đã được chứng minh là đủ để phát hiện hầu hết các vi khuẩn và nấm. Phương pháp được chọn bởi mỗi nhà sản xuất nên được xác nhận và chuẩn hóa cẩn thận. Các phương pháp thay thế được chấp nhận khi có thể chứng minh thành công mức thu hồi cao (>90%) của các vi sinh vật quan tâm.”
USP 41 <1116> Kiểm soát và giám sát vi sinh vật trong môi trường xử lý vô trùng (2018)
“Thông thường, đối với các môi trường nuôi cấy vi sinh như SCDM (Môi trường Đạm Casein Đậu nành), các nhiệt độ ủ từ khoảng 20–35°C đã được sử dụng, với thời gian ủ kéo dài không dưới 72 giờ. Thời gian ủ dài hơn có thể được xem xét khi các chất ô nhiễm được biết đến là phát triển chậm. Các khoảng nhiệt độ nêu trên không bắt buộc. Các vi khuẩn mesophilic và nấm mốc phổ biến trong môi trường cơ sở thường có khả năng phát triển ở một dải nhiệt độ rộng. Đối với nhiều sinh vật mesophilic, việc phục hồi có thể xảy ra ở khoảng 20°C.
Trong trường hợp thiếu bằng chứng xác nhận, các nhà vi sinh có thể ủ một đĩa ở cả nhiệt độ thấp và cao. Việc ủ ở nhiệt độ thấp trước có thể làm giảm khả năng phục hồi các cocci Gram dương, điều quan trọng vì chúng thường liên quan đến sự can thiệp của con người.”
Dược điển Nhật Bản JP Phần G4 Đánh giá Vi sinh trong Các Khu vực Xử lý cho Các Sản phẩm Dược vô trùng, Dược điển Nhật Bản 17 mô tả các môi trường và điều kiện nuôi cấy có thể được áp dụng để phát hiện các vi sinh vật khác nhau (xem bảng 1 dưới đây).
| Vi sinh vật được phát hiện | Môi trường nuôi cấy | Điều kiện nuôi cấy |
| Aerobes | Soybean-casein digest agar (or fluid) medium Brain-heart infusion agar (or fluid) medium Nutrient agar (or fluid) medium | 30-35°C Hơn 5 ngày |
| Yeast and fungi | Soybean-casein digest agar (or fluid) medium Sabureau dextrose agar (or fluid) medium Potato-dextrose agar (or fluid) medium Glucose peptone agar (or fluid) medium |
20-25°C Hơn 5 ngày |
| Anaerobes | Soybean-casein digest agar (or fluid) medium Fluid cooked meat medium Reinforced clostridial agar (or fluid) medium Thioglycolate medium I (or thioglycolate agar medium) for sterility test | 30-35°C Hơn 5 ngày |
Bảng 1: Môi trường và điều kiện nuôi cấy
Thông tin bổ sung cũng được cung cấp trong tài liệu này để cải thiện việc phát hiện vi sinh vật:
- “Nếu cần thiết, có thể thêm kháng sinh vào môi trường với nồng độ phù hợp (xem kiểm tra giới hạn vi sinh vật), nếu nghi ngờ có sự hiện diện của chất khử trùng có thể làm nhiễu kết quả kiểm tra trên bề mặt mẫu.
- Khi sử dụng môi trường agar đạm đậu nành-casein để phát hiện vi khuẩn hiếu khí, nấm men và nấm mốc, việc ủ ở 25–30°C trong hơn năm ngày là chấp nhận được.
- Nếu có thể có được số lượng chính xác trong thời gian ủ ngắn hơn năm ngày, có thể áp dụng phương pháp này.
- Thông thường, các vi khuẩn kỵ khí không phải là mục tiêu của việc giám sát. Để phát hiện các vi khuẩn kỵ khí, môi trường agar nên được ủ trong một bình kỵ khí phù hợp.”
Một khảo sát thực hiện bởi Hiệp hội Dược phẩm Parenteral (PDA) cho thấy gần 60% các công ty dược phẩm được khảo sát đã chọn ủ ở hai nhiệt độ là phương pháp phổ biến nhất của họ. Ít hơn một chút so với 30% đã chọn ủ mẫu một nhiệt độ. Hiện nay, ngày càng nhiều người đang xem xét việc áp dụng ủ mẫu một nhiệt độ: theo một khảo sát năm 2023, 70,8% các nghiên cứu viên hiện đang sử dụng ủ hai nhiệt độ và sẵn sàng chuyển sang sử dụng ủ mẫu một nhiệt độ.
Thách thức của việc ủ mẫu một nhiệt độ/Một môi trường
Tổng quan yêu cầu bắt buộc về ủ mẫu một nhiệt độ/Một môi trường của PDA
Vào năm 2018, PDA đã thành lập một nhóm công tác One Media / One Temperature với sự tham gia của tám nhà sản xuất dược phẩm khác nhau, nhằm đánh giá các lợi ích chính của việc áp dụng ủ mẫu một nhiệt độ duy nhất trong giám sát môi trường (EM).
Kết quả chính: Nghiên cứu in vitro 2019–2020
Đánh giá thử nghiệm khuyến khích sự phát triển chứa hai môi trường (TSA không có chất trung hòa) và ba điều kiện so sánh:
- 27,5°C / bảy ngày
- 22,5°C / bốn ngày, sau đó 32,5°C / ba ngày
- 32,5°C / ba ngày, sau đó 22,5°C / bốn ngày
Đối với tổng cộng 13 chủng ATCC với tám loại vi khuẩn, hai loại nấm men và ba loại nấm mốc, nghiên cứu kết luận rằng một khoảng thời gian ủ duy nhất ở 27,5°C hoạt động tốt như các khoảng thời gian ủ hai nhiệt độ (chuỗi thấp / cao và cao / thấp).
Nghiên cứu của BioMérieux
Sơ đồ dưới đây minh họa đề xuất chuyển sang phương pháp sử dụng một môi trường nuôi cấy / một nhiệt độ. Trước khi bắt đầu, khuyến nghị nên tìm hiểu về hệ vi sinh vật tự nhiên trong môi trường của cơ sở, bằng cách nghiên cứu điều kiện phục hồi vi sinh vật trên môi trường TSA ở nhiệt độ 32,5°C và sử dụng môi trường SDA ở nhiệt độ 22,5°C. Nếu dữ liệu cho phép chứng minh khả năng phục hồi của nấm mốc trên TSA, thì có thể chuyển sang sử dụng một môi trường nuôi cấy và hai nhiệt độ.
Bước cuối cùng liên quan đến việc đánh giá tính khả thi của việc chuyển đổi sang một nhiệt độ ủ duy nhất. Để thực hiện điều này, cần phải xác minh độ tin cậy của khả năng phục hồi tất cả các loài vi sinh vật đã được xác định trước đó bằng cách tạo ra dữ liệu so sánh ở hai nhiệt độ. Kết quả của quy trình thử nghiệm tính phù hợp này (hình 2) đã được tuân theo và sẽ được trình bày trong phần thứ hai của tài liệu này.
Nhưng thách thức với Một nhiệt độ
Mục tiêu của các nghiên cứu (PDA và bioMérieux / Sanofi) là tìm ra nhiệt độ phù hợp để phát hiện nấm men và nấm mốc (số lượng và đa dạng) hiệu quả như ở 22,5°C. Nấm chỉ chiếm không quá 5% tổng số vi sinh vật thường được phát hiện trong các chương trình giám sát môi trường, nhưng chúng gây ra mối đe dọa thực sự do khả năng bào tử của chúng. Các vi khuẩn hiếu khí mesophilic thường được mang vào các phòng sạch bởi con người và là sự ô nhiễm thường gặp nhất (95% vi sinh vật được phát hiện). Thách thức của các nghiên cứu này là tìm ra một nhiệt độ phổ quát cho phép phát hiện tất cả các loại vi sinh vật trong phòng sạch về số lượng và sự đa dạng hiệu quả như các chế độ ủ hai nhiệt độ hiện tại.
Nấm là vi sinh vật hiếu khí, và phạm vi nhiệt độ ủ của chúng rất rộng: 10–35°C. Sự phát triển tối ưu xảy ra trên môi trường malt extract agar và dưới nhiệt độ ủ 26–30°C. Các vi khuẩn hiếu khí mesophilic nên phát triển trong phạm vi 20–35°C. Kết luận là 27,5°C là nhiệt độ phát triển tối ưu cho cả vi khuẩn hiếu khí mesophilic và nấm.
Khi tiến hành giám sát môi trường trong các khu vực sạch, các nhà sản xuất dược phẩm nhằm mục đích phát hiện tất cả các tác nhân gây ô nhiễm có mặt tại thời điểm lấy mẫu, mà không có kiến thức trước về các vi sinh vật cụ thể có mặt tại điểm và thời gian lấy mẫu.
Mỗi vi sinh vật có các tiêu chí phát triển riêng của nó về thành phần môi trường nuôi cấy, nhiệt độ và thời gian ủ. Các điều kiện phát triển tối ưu liên quan đến tính đặc thù của từng vi sinh vật rất khó thực hiện trong giám sát môi trường và cần phải đạt được sự đồng thuận để tìm ra sự cân bằng tốt cho hệ vi sinh vật hiện có.
Do đó, tất cả các thông số lấy mẫu và ủ phải được xác định dựa trên phân tích xu hướng và rủi ro, cũng như các xác thực nội bộ. Điều này bao gồm việc chọn môi trường nuôi cấy hiệu quả hỗ trợ sự phát triển của một loạt các vi sinh vật, ngay cả trong điều kiện căng thẳng, cũng như xác định nhiệt độ ủ và thời gian phù hợp.
Chúng tôi tin rằng phương pháp ủ mẫu một nhiệt độ mang lại lợi ích đáng kể cho ngành công nghiệp dược phẩm và có thể chứng minh kết quả tương đương với các phương pháp ủ hai nhiệt độ
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các Thiết bị giám sát môi trường hãng BioMérieux.
EN