Kỹ thuật tăng cường độ tương phản ánh sáng truyền qua kính hiển vi

Giới thiệu

Trong kính hiển vi quang học, chất lượng mẫu vật không phải lúc nào cũng cho phép quan sát dễ dàng và chụp lại hình ảnh với độ tương phản tốt ở chế độ chụp ảnh trường sáng thông thường. Các nghiên cứu xử lý các mẫu vốn có độ tương phản thấp, chẳng hạn như vi khuẩn không nhuộm, mẫu mô mỏng và tế bào sống kết dính cần các kỹ thuật tăng cường độ tương phản chuyên dụng để hỗ trợ chụp ảnh các mẫu hầu như trong suốt này. Trong quá trình kiểm tra các mẫu không nhuộm màu, sự hấp thụ ánh sáng kém của mẫu dẫn đến sự khác biệt rất nhỏ về sự phân bố cường độ giữa mẫu và nền. Khi nền sáng, mắt người cần cường độ ánh sáng dao động ít nhất từ ​​10 đến 20 phần trăm để có thể thấy chi tiết mẫu. Tuy nhiên, mức độ này hiếm khi được nhìn thấy với các mẫu vật trong suốt, chúng thường được hiển thị gần như vô hình trên nền có cường độ tương tự. Thuật ngữ ánh sáng truyền qua, khi được sử dụng trong kính hiển vi quang học, đề cập đến bất kỳ phương thức tạo ảnh nào trong đó ánh sáng được truyền từ nguồn chiếu sáng ở phía đối diện của mẫu tới vật kính (do đó, ánh sáng được truyền qua mẫu) . Các kỹ thuật tăng cường độ tương phản được mô tả trong phần này đại diện cho nhiều phương pháp chuẩn bị mẫu cũng như các thủ thuật quang học tạo ra sự thay đổi cường độ hữu ích cho việc quan sát và chụp ảnh.

Các phương pháp tăng cường độ tương phản bao gồm độ tương phản giao thoa chênh lệch (DIC), ánh sáng phân cực, độ tương phản pha, độ tương phản điều chế Hoffman và kính hiển vi trường tối (các ví dụ được minh họa trong Hình 1). Một số kỹ thuật trong số này bị giới hạn bởi ánh sáng bắt nguồn từ các vùng bị loại bỏ khỏi mặt phẳng tiêu điểm khi chụp ảnh các mô động vật và thực vật dày hơn, trong khi ánh sáng phân cực yêu cầu tính lưỡng chiết (thường không xuất hiện ở mức độ đáng kể trong tế bào động vật) để tạo ra độ tương phản.

Minh họa trong Hình 1 là một loạt các kỹ thuật tăng cường độ tương phản phổ biến thường được sử dụng trong kính hiển vi quang học. Phần mô mỏng trong Hình 1(a) cho thấy ung thư biểu mô tế bào đáy của người được nhuộm bằng eosin và hematoxylin để tạo độ tương phản màu trong chế độ chụp ảnh trường sáng. Hình 1(b) cho thấy các tế bào HeLa sống trong bình nhựa nuôi cấy mô được tạo ảnh với độ tương phản pha. Môi trường nước gán liền với các tế bào Mang Ấn Độ được trình bày trong hình ảnh tương phản giao thoa chênh lệch trong Hình 1(c). Một phần mô mới của cơ tim chuột được ngâm trong dung dịch nước muối được hiển thị trong bảng Hình 1(d), trong đó độ tương phản được tạo ra bằng cách sử dụng độ tương phản điều chế Hoffman (hoặc ZEISS VAREL), một kỹ thuật chiếu sáng xiên. Độ tương phản sáng-tối rõ nét quan sát được với chiếu sáng trường tối được thể hiện trong Hình 1(e) bằng cách sử dụng mẫu thủy tức Obelia. Cuối cùng, các sợi cơ xương thỏ (Hình 1(f)) nằm trong số các mẫu sinh học có khả năng lưỡng chiết và thể hiện độ tương phản trong ánh sáng phân cực.

Kính hiển vi trường sáng

Một trong những kỹ thuật chính được sử dụng trong tất cả các dạng kính hiển vi quang học trong ba thế kỷ qua, chiếu sáng trường sáng dựa trên những thay đổi về độ hấp thụ ánh sáng, chỉ số khúc xạ hoặc màu sắc để tạo ra độ tương phản. Khi ánh sáng đi qua mẫu vật, các vùng làm thay đổi hướng, tốc độ và/hoặc quang phổ của mặt sóng tạo ra sự khác biệt quang học (độ tương phản) khi các tia được vật kính thu thập và hội tụ. Độ phân giải trong hệ thống trường sáng phụ thuộc vào cả khẩu độ số của vật kính và tụ quang, và môi trường ngâm được yêu cầu ở cả hai mặt của mẫu (đối với các tổ hợp khẩu độ số vượt quá giá trị 2,3). Máy ảnh kỹ thuật số cung cấp dải động rộng và độ phân giải không gian cần thiết để nắm bắt thông tin có trong hình ảnh trường sáng. Ngoài ra, các thuật toán trừ nền, sử dụng các khung hình trung bình được chụp không có mẫu trong đường dẫn quang học, làm tăng độ tương phản đáng kể.

Hình ảnh trường sáng thông thường, với kính hiển vi được điều chỉnh phù hợp để chiếu sáng Köhler, cung cấp một lượng thông tin hạn chế về đường viền tế bào, vị trí hạt nhân và vị trí của các túi lớn hơn trong các mẫu không nhuộm. Độ tương phản trong hình ảnh trường sáng phụ thuộc vào sự khác biệt về độ hấp thụ ánh sáng, chỉ số khúc xạ hoặc màu sắc. Sự chênh lệch quang học (độ tương phản) được phát triển khi ánh sáng đi qua mẫu vật làm thay đổi hướng, tốc độ hoặc đặc điểm quang phổ của mặt sóng hình ảnh. Kỹ thuật này hữu ích hơn với các mẫu được nhuộm bằng thuốc nhuộm hấp thụ ánh sáng khả kiến ​​(chẳng hạn như eosin và hematoxylin; xem Hình 1(a)). Tuy nhiên, việc thiếu độ tương phản chung trong chế độ trường sáng khi kiểm tra các mẫu không nhuộm màu khiến kỹ thuật này tương đối không hiệu quả đối với các nghiên cứu sâu về cấu trúc tế bào sống.

Kính hiển vi tương phản pha

Được mô tả lần đầu tiên vào năm 1934 bởi Frits Zernike – nhà vật lý và toán học người Hà Lan, độ tương phản pha đã giúp ông đạt giải thưởng Nobel về vật lý năm 1953 trong cách mạng hóa nghiên cứu y sinh cơ bản về tế bào sống. Kỹ thuật này lý tưởng cho các mẫu vật mỏng không nhuộm màu (chẳng hạn như tế bào nuôi cấy trên thủy tinh), dày khoảng 5 đến 10 micromet phía trên nhân, nhưng dày dưới một micromet ở ngoại vi. Những mẫu vật như vậy hầu như không thể hiện bất kỳ sự hấp thụ ánh sáng nào trong phần nhìn thấy được của quang phổ và mắt người không thể phát hiện ra chúng trong trường sáng và trường tối. Độ tương phản pha (như được minh họa trong Hình 1(b)) sử dụng một cơ chế quang học để chuyển đổi những thay đổi nhỏ về pha thành những thay đổi tương ứng về biên độ, có thể được hình dung như những khác biệt về độ tương phản của hình ảnh.Ph ) ở mặt phẳng tiêu điểm phía sau (các vật kính tương phản pha cũng có thể được sử dụng với huỳnh quang, nhưng giảm một chút độ truyền sáng). Tương phản pha là một phương pháp tuyệt vời để tăng độ tương phản khi xem hoặc chụp ảnh các tế bào sống trong quá trình nuôi cấy, nhưng thường dẫn đến các quầng sáng xung quanh đường viền của các điểm cạnh. Những quầng sáng này là tạo tác động quang học thường làm giảm khả năng hiển thị của các chi tiết ranh giới. Kỹ thuật này không hữu ích đối với các mẫu vật dày (chẳng hạn như các phần mô thực vật và động vật) vì sự lệch pha xảy ra ở các vùng bị loại khỏi mặt phẳng tiêu điểm làm biến dạng chi tiết hình ảnh. Hơn nữa, các mảnh vụn và các vật thể nằm ngoài tiêu điểm khác cản trở việc tạo ảnh các tế bào bám dính trên lam dán

Như được trình bày trong Hình 2, tồn tại những khác biệt rất nhỏ giữa chiết suất của tế bào và dung dịch nước bao quanh chúng và bên trong tế bào giữa tế bào chất (Hình 2(b)) và nhân tế bào (Hình 2(c)). Không có sự khác biệt đáng kể về chỉ số khúc xạ xảy ra trong lớp phủ và môi trường xung quanh (Hình 2 (a)). Độ tương phản pha làm cho những khác biệt nhỏ này có thể nhìn thấy được bằng cách sử dụng thao tác quang học chẳng hạn như chuyển chúng thành những khác biệt về cường độ có thể được quan sát và ghi lại bằng mắt thường. Hiệu ứng quang học được sử dụng trong trường hợp này bao gồm sự dịch chuyển các pha giữa các mặt sóng ánh sáng truyền qua các phần khác nhau của mẫu vật. Trong quá trình qua nhân tế bào, tế bào chất hoặc nước, các sóng ánh sáng bị dịch chuyển (chậm lại) ở mức độ nhỏ, vì các môi trường này có chiết suất hơi khác nhau (chiết suất của môi trường càng cao thì tốc độ hoặc vận tốc ánh sáng trong môi trường càng nhỏ). Kết quả là, sóng ánh sáng truyền qua nhân tế bào sẽ chậm hơn so với sóng ánh sáng chỉ truyền qua nước (so sánh Hình 2(a) và Hình 2(c)). Lượng độ trễ được gọi là dịch chuyển pha. Trước khi chúng đi vào mẫu vật, các sóng vẫn cùng pha (các mặt sóng bên dưới lớp phủ), nhưng điều này không còn xảy ra khi chúng đi qua các vật liệu khác nhau có chỉ số khúc xạ khác nhau. Mức độ lệch pha phụ thuộc vào phương tiện nào (chỉ số khúc xạ) mà sóng truyền qua trên đường đi của chúng và thời gian đường đi qua các phương tiện này. Mắt người không thể nhìn thấy những chuyển pha này trong hình ảnh kính hiển vi, nó chỉ có thể phân biệt giữa các cường độ và màu sắc khác nhau. Do đó, kỹ thuật tương phản pha sử dụng các thủ thuật quang học để chuyển dịch pha thành giá trị xám.

Trong cấu hình kính hiển vi tương phản pha, màng chắn khẩu độ tụ quang được thay thế bằng một điểm dừng pha (kích thước phụ thuộc vào vật kính và khẩu độ số của tụ quang) chiếu sáng mẫu qua các thành phần quang học của tụ quang theo kiểu ánh sáng hình nón rỗng, như minh họa trong Hình 3(a). Các mặt sóng này đi vào vật kính và hình ảnh của điểm dừng pha được tạo ra ở mặt phẳng tiêu điểm phía sau (đồng tử vật kính). Được định vị bên trong mặt phẳng tiêu điểm phía sau vật kính là một vòng pha hoặc tấm không chỉ làm giảm ánh sáng trực tiếp, sáng bắt nguồn từ điểm dừng pha trong tụ quang, mà còn bổ sung thêm sự dịch pha không đổi cho ánh sáng này. Nếu mẫu vật chứa các cấu trúc phụ có chiết suất hỗn hợp, thì các thực thể này sẽ dẫn ánh sáng từ các sóng trực tiếp vào các đường đi mới (đường chấm màu đỏ trong Hình 3(a)). Các mặt sóng bị nhiễu xạ bởi mẫu vật (thực tế là những mặt sóng chứa thông tin cấu trúc) sẽ không đi qua vòng pha trong vật kính, nghĩa là chúng sẽ không bị suy giảm hoặc chậm lại. Tất cả các mặt sóng cuối cùng được kết hợp lại để tạo thành hình ảnh trung gian bằng thấu kính ống.

Tất cả các mặt sóng bị làm chậm lại ở các mức độ khác nhau bởi các chi tiết trong mẫu vật được xếp chồng lên nhau trong hình ảnh trung gian trên các mặt sóng bị dịch chuyển và suy giảm, nơi chúng khuếch đại hoặc làm suy giảm lẫn nhau (tùy thuộc vào pha), tạo thành hình ảnh tương phản pha cuối cùng được quan sát thấy trong thị kính. Các quá trình giao thoa này trong ảnh trung gian tạo ra các vùng sáng và tối của các cấu trúc khác nhau có chỉ số khúc xạ (và/hoặc độ dày) thay đổi trong mẫu vật. Độ tương phản tối ưu được tạo ra bằng cách chọn các giá trị độ trễ và độ suy giảm chính xác, đây là hàm của các đặc tính quang học của vòng pha trong khẩu độ vật kính.

Một hiện tượng chính của hình ảnh tương phản pha là quầng sáng của ánh sáng xuất hiện trên các đường viền xung quanh mẫu vật. Quầng sáng xảy ra trong kính hiển vi tương phản pha vì vòng trễ pha hình tròn (và mật độ trung tính) nằm trong tấm pha vật kính cũng truyền một mức độ nhỏ ánh sáng nhiễu xạ từ mẫu vật (nó không bị hạn chế chỉ truyền sóng bao quanh). Vấn đề trở nên phức tạp hơn bởi thực tế là chiều rộng của mặt sóng bao quanh ánh sáng không bị nhiễu xạ (bậc 0) được chiếu lên vật kính phản phase bởi hình khuyên tụ trong quang nhỏ hơn chiều rộng thực của vòng vật kính phản pha. Các mẫu vật dày, thường thể hiện các cấu trúc chồng chéo cao, tạo ra nhiều quầng sáng. Do đó, tương phản pha là một phương pháp chỉ được khuyến nghị cho các mẫu vật rất mỏng trong đó một số cấu trúc không nằm chồng lên nhau về mặt vật lý. Trong một mẫu vật dày, các chi tiết có thể được pha trộn thành một hình ảnh, trong phân tích cuối cùng, không còn rõ ràng nữa.

Độ tương phản pha yêu cầu các vật kính đặc biệt được trang bị vòng pha gần đồng tử hoặc khẩu độ phía sau. Chúng rất dễ nhận biết bằng dòng chữ màu xanh biểu thị kích thước của điểm dừng pha tụ điện tương ứng: Ph1 , Ph2 hoặc Ph3 . Nếu bạn giữ một vật kính như vậy ngược với ánh sáng và nhìn vào từ đầu ren, bạn sẽ có thể nhìn thấy vòng pha màu xám/trong suốt. Bộ ngưng tụ yêu cầu một, hai hoặc ba điểm dừng pha, tùy thuộc vào vật kính tương phản pha được gắn vào đầu kính hiển vi. Đường kính vòng yêu cầu tăng theo khẩu độ số (khẩu độ cao yêu cầu đường kính tối đa ( Ph3), ví dụ 0,9 trong không khí hoặc 1,3 khi ngâm trong dầu). Ba kích cỡ có sẵn và đủ cho tất cả các mục tiêu (Hình 3(b)). Nếu bạn sử dụng độ tương phản pha chỉ với một kích thước vòng, thì một điểm dừng plug-in dễ dàng gắn và tháo rời cho tụ quang là đủ. Một đĩa tháp với một số giá đỡ sẽ thuận tiện hơn, vì nó chứa tất cả ba điểm dừng pha và cho phép chuyển đổi rất nhanh trong quá trình chụp ảnh. Các khẩu độ mở cần thiết trong chiếu sáng trường sáng và cho màng chắn trường tối.

Các điểm dừng pha phải được căn giữa sau khi chúng được lắp vào tụ quang sao cho hình ảnh của điểm dừng pha trong đồng tử vật kính tương ứng chính xác với vị trí của vòng pha trong đường chùm tia (xem Hình 4(c)). Định tâm được thực hiện bằng cách sử dụng hai cờ lê nhỏ (hoặc tua vít, tùy thuộc vào kiểu kính hiển vi) trên đĩa tháp của thiết bị ngưng tụ. Nếu bạn muốn đặc biệt chính xác, hãy sử dụng kính viễn vọng định tâm để quan sát khẩu độ phía sau của vật kính để thực hiện các điều chỉnh này, như minh họa trong Hình 4. Phụ kiện nhỏ này trông giống như một thị kính và được lắp vào ống quan sát thay cho thị kính. Khi kính viễn vọng tập trung vào con ngươi (khẩu độ phía sau) của vật kính, có thể quan sát rõ vị trí của các điểm dừng pha. Lại, soi vào đồng tử vật kính và đưa ảnh sáng của vòng pha ngưng tụ trùng với vòng pha của vật kính. Điều này được thể hiện rõ ràng trong Hình 4. Trong Hình 4(a) và 4(b), điểm dừng pha không thẳng hàng với tấm pha vật kính, trong khi điểm dừng và tấm pha hoàn toàn đồng dạng trong Hình 4(c).

Hình ảnh của mẫu vật ở độ tương phản pha có thể bị ảnh hưởng bằng cách chọn độ trễ thích hợp của chùm tia trực tiếp (không bị nhiễu xạ) thông qua việc lựa chọn cẩn thận vòng pha trong vật kính. Tùy thuộc vào giá trị độ trễ được chọn, các vật thể có chỉ số khúc xạ cao hơn môi trường xung quanh sẽ sáng hơn hoặc tối hơn môi trường xung quanh. Điều này còn được gọi là độ tương phản pha dương hoặc âm. Trong kính hiển vi hiện đại, độ tương phản pha dương là tiêu chuẩn, trong đó độ tối của các đặc điểm vật thể tăng theo chiết suất của chúng. Hiệu ứng mô phỏng sự hấp thụ đối với mắt người quan sát ở những khu vực có chỉ số khúc xạ cao hơn tạo ra các đặc điểm có độ tương phản cao. Điều này được coi là tối ưu, đặc biệt với tế bào và mô trong môi trường nước vì nhân tế bào và bào quan, ví dụ, xuất hiện tối hơn so với tế bào chất. Đối với một số ứng dụng, chẳng hạn như kiểm tra tế bào tinh trùng, độ tương phản pha âm có thể tạo ra nhiều chi tiết mẫu vật hơn so với độ tương phản pha dương truyền thống.

Kính hiển vi tương phản chênh lệch

Kính hiển vi tương phản giao thoa chênh lệch ( DIC; Hình 1(c)) yêu cầu ánh sáng phân cực phẳng và lăng kính cắt ánh sáng bổ sung (Nomarski) để phóng đại sự khác biệt nhỏ về độ dày mẫu vật và chỉ số khúc xạ. Ví dụ, hai lớp lipid tạo ra độ tương phản tuyệt vời trong DIC do sự khác biệt về chỉ số khúc xạ giữa các pha nước và lipid của tế bào. Ngoài ra, ranh giới tế bào trong các tế bào thực vật và động vật có vú tương đối phẳng, bao gồm màng sinh chất, nhân, không bào, ty thể và các sợi ứng suất, thường tạo ra độ dốc đáng kể, dễ dàng được tạo ảnh bằng DIC. Trong các mô thực vật, thành tế bào lưỡng chiết làm giảm độ tương phản trong DIC ở một mức độ hạn chế, nhưng một hệ thống được căn chỉnh phù hợp sẽ cho phép hình dung màng nhân và màng không bào, một số ty thể, lục lạp và nhiễm sắc thể ngưng tụ trong tế bào biểu bì. Độ tương phản giao thoa chênh lệch là một kỹ thuật quan trọng để chụp ảnh các mô động vật và thực vật dày vì ngoài độ tương phản tăng lên, DIC còn thể hiện độ sâu trường ảnh giảm ở khẩu độ rộng, tạo ra tiết diện quang học mỏng của mẫu vật dày. Hiệu ứng này cũng thuận lợi cho việc chụp ảnh các tế bào kết dính để giảm thiểu hiện tượng mờ phát sinh từ các mảnh vụn trôi nổi trong môi trường nuôi cấy.

Hệ thống quang học tương phản giao thoa chênh lệch dựa trên kỹ thuật tương phản ánh sáng phân cực khi có liên quan đến nhiều thành phần được sử dụng. DIC đối với kính hiển vi ánh sáng truyền qua hiện đại khác với ánh sáng phản xạ bởi vì hai lăng kính lưỡng chiết được sử dụng (xem Hình 6) và sự khác biệt về đường quang học của mẫu vật được xác định bởi tích của hiệu số chiết suất (giữa mẫu vật và môi trường xung quanh nó). ) và độ dày (khoảng cách hình học) mà chùm sáng đi qua giữa hai điểm trên quang lộ (Hình 5). Hình ảnh được tạo ra trong kính hiển vi tương phản giao thoa chênh lệch được đặc trưng bởi sự chiếu bóng đặc biệt, như thể chúng được chiếu sáng từ một nguồn sáng có độ xiên cao bắt nguồn từ một phương vị duy nhất. Hiệu ứng này thường sẽ làm cho một mẫu vật trong tình trạng ba chiều giả (Hình 6 (d)), thường được các nhà nghiên cứu tưởng như là một chỉ số về cấu trúc địa hình thực tế.

Hình 6 minh họa đường đi của chùm tia tương phản giao thoa vi sai tương tự như đường đi của ánh sáng truyền qua phân cực. Trong DIC (so với ánh sáng phân cực), hai lăng kính lưỡng chiết (Hình 6(b)) được lắp vào hệ thống quang học, một ở trong tụ quang và lăng kính thứ hai ở gần đồng tử vật kính. Lăng kính tụ điện thực hiện phân tách theo vectơ của ánh sáng đã phân cực tuyến tính trước đó (Hình 6(c)) thành hai hướng dao động được phân cực vuông góc với nhau và dịch chuyển các chùm tia này theo phương ngang sao cho có sự dịch chuyển ngang nhỏ của các mặt sóng, xảy ra ở những vùng có độ dày hoặc chỉ số khúc xạ khác nhau. Nếu hai chùm tia hiện tại đi qua chính xác các cấu trúc giống nhau, thì sẽ không có sự khác biệt về đường đi nữa trong mẫu vật (Hình 5(a) và Hình 5(c)). Tuy nhiên, nếu hai chùm tia một phần nhìn thấy các điều kiện hơi khác nhau, mỗi chùm tia sẽ trải qua một độ dài đường đi hơi khác nhau đi kèm với nó đến mặt phẳng hình ảnh trung gian (Hình 5(b)).

Như đã thảo luận, các chùm ánh sáng DIC phân tách đi qua mẫu vật nơi các đường sóng của chúng bị thay đổi theo độ dày, độ dốc và chỉ số khúc xạ khác nhau của mẫu vật. Những biến thể này gây ra sự thay đổi trong đường truyền sóng của cả hai chùm tia đi qua các khu vực của bất kỳ chi tiết mẫu vật nào nằm gần nhau. Khi các chùm tia song song đi vào vật kính, chúng được hội tụ phía trên mặt phẳng tiêu điểm phía sau nơi chúng đi vào lăng kính DIC thứ hai kết hợp hai chùm tia ở một khoảng cách xác định bên ngoài lăng kính. Điều này loại bỏ lực cắt (khoảng cách giữa các sóng) và sự khác biệt về đường đi ban đầu giữa các cặp chùm tia. Do đi ngang qua mẫu vật, đường đi của các chùm tia song song không có cùng độ dài (chênh lệch đường quang học) đối với các khu vực khác nhau của mẫu vật.

Để các chùm giao thoa với nhau, các dao động của các chùm có chiều dài đường đi khác nhau phải được đưa vào cùng một mặt phẳng và trục. Điều này được thực hiện bằng cách đặt một bộ phân cực thứ hai (máy phân tích) phía trên lăng kính kết hợp chùm tia DIC phía trên. Sau đó, ánh sáng đi về phía thị kính, nơi nó có thể được quan sát thấy dưới dạng sự khác biệt về cường độ và màu sắc. Kết quả thiết kế là một mặt của chi tiết mẫu có vẻ sáng (hoặc có thể có màu) trong khi mặt còn lại có vẻ tối hơn (hoặc màu khác). Hiệu ứng tạo bóng này mang lại diện mạo ba chiều giả cho mẫu vật được mô tả ở trên. Có rất nhiều ưu điểm trong kính hiển vi DIC so với kính hiển vi tương phản pha. Với DIC, có thể tận dụng tối đa khẩu độ số của hệ thống và cung cấp khả năng nhuộm quang học (màu). DIC cũng cho phép kính hiển vi đạt được độ phân giải cao. Việc sử dụng khẩu độ vật kính đầy đủ cho phép nhà nghiên cứu tập trung vào phần mặt phẳng mỏng của mẫu vật dày mà không gây nhầm lẫn hình ảnh từ bên trên hoặc bên dưới mặt phẳng. Các quầng sáng gây khó chịu, thường gặp trong tương phản pha, không có trong ảnh DIC và có thể sử dụng các vật kính tiêu sắc và fluorite phù hợp cho công việc này. Tuy nhiên, điều quan trọng cần lưu ý là vì DIC dựa trên các nguyên tắc ánh sáng phân cực, không nên quan sát các mẫu có tính lưỡng chiết cao hoặc những mẫu được nhúng trong vật liệu lưỡng chiết trong DIC, không có trong hình ảnh DIC và có thể sử dụng các vật kính achromat và fluorite phù hợp cho công việc này. Tuy nhiên, điều quan trọng cần lưu ý là vì DIC dựa trên các nguyên tắc ánh sáng phân cực, nên không nên quan sát các mẫu có tính lưỡng chiết cao hoặc những mẫu được nhúng trong vật liệu lưỡng chiết trong DIC. không có trong hình ảnh DIC và có thể sử dụng các vật kính achromat và fluorite phù hợp cho công việc này. Tuy nhiên, điều quan trọng cần lưu ý là vì DIC dựa trên các nguyên tắc ánh sáng phân cực, nên không nên quan sát các mẫu có tính lưỡng chiết cao hoặc những mẫu được nhúng trong vật liệu lưỡng chiết trong DIC.

Điều chế Hoffman và Tương phản VAREL

Thường được gọi một cách ẩn dụ là “poor man’s DIC”, độ tương phản điều chế Hoffman ( HMC) là một kỹ thuật chiếu sáng xiên giúp tăng cường độ tương phản trong các tế bào và mô sống bằng cách phát hiện các gradient pha quang học (xem Hình 1(d)). Cấu hình cơ bản của kính hiển vi bao gồm một bộ lọc không gian biên độ quang học, được gọi là bộ biến điệu, được lắp vào mặt phẳng tiêu điểm phía sau của vật kính. Cường độ ánh sáng đi qua bộ biến điệu thay đổi trên và dưới giá trị trung bình, theo định nghĩa, khi đó được cho là đã điều chế. Kết hợp với bộ điều biến vật kính là một khe hở ngoài trục được đặt trong mặt phẳng tiêu cự phía trước của tụ quang để hướng ánh sáng xiên về phía mẫu vật. Không giống như tấm pha trong kính hiển vi tương phản pha, bộ biến điệu Hoffman được thiết kế để không làm thay đổi pha của ánh sáng đi qua; thay vào đó, nó ảnh hưởng đến cực đại bậc 0 chính để tạo ra độ tương phản. Độ tương phản điều chế Hoffman không bị cản trở bởi việc sử dụng các vật liệu lưỡng chiết (chẳng hạn như đĩa Petri bằng nhựa) trong đường dẫn quang học, vì vậy kỹ thuật này hữu ích hơn để kiểm tra mẫu vật trong các vật chứa được chế tạo bằng vật liệu polyme. Mặt khác, HMC tạo ra một số tạo phẩm quang học làm cho kỹ thuật này kém hữu ích hơn một chút so với độ tương phản pha hoặc DIC đối với hình ảnh tế bào sống trên nắp đậy thủy tinh.

Một kỹ thuật tương phản mới được phát triển, trong đó độ tương phản pha được kết hợp với chiếu sáng đơn phương nghiêng (tương tự như HMC), đã được phát triển để kiểm tra các tế bào sống trong bình nuôi cấy. Một điểm dừng bổ sung có hình dạng giống như một khu vực vòng được sử dụng ở phía chiếu sáng, cho phép chiếu sáng nghiêng một bên. Ba chế độ chiếu sáng, trường tối đơn phương, độ tương phản VAREL (độ sáng thay đổi) và trường sáng nghiêng (tương tự như chiếu sáng xiên hoặc HMC) được thiết lập bằng cách dịch chuyển điểm dừng theo hướng xuyên tâm từ ngoài vào trong (xem Hình 7) và một đoạn của một vòng phù hợp được di chuyển vào vị trí. Khe này hướng nguồn chiếu sáng đi qua vòng thứ hai có độ hấp thụ cao ở ngoại vi của khẩu độ vật kính, cái triệt tiêu cường độ của nó bằng một lượng phụ thuộc vào mật độ của vòng ngoài. Các bậc ánh sáng nhiễu xạ đi qua vật kính mà không bị vòng VAREL triệt tiêu. Bạn cũng có thể điều chỉnh vị trí của khe nếu bạn muốn thay đổi mức độ chiếu sáng của nguồn.

Định hướng dễ dàng đạt được và duy trì do bản chất đồng tâm của khe. Hơn nữa, do vị trí của vòng VAREL trong vật kính, VAREL và vòng tương phản pha có thể được kết hợp trong cùng một vật kính. Điều này tạo ra một phương pháp chụp ảnh tế bào giá rất thấp trong các bình nuôi cấy. Các vấn đề về chụp ảnh trong cả ứng dụng nuôi cấy mô truyền thống và thông thường có thể được giải quyết bằng phương pháp này, đây là một lựa chọn thành công để kiểm tra các vật thể sống (vi thao tác) và một loạt các cấu trúc có độ dày quang học khác nhau được chụp ảnh dễ dàng bằng VAREL. Ngay cả các bình nuôi cấy có đáy cong cũng cho phép tạo ra hình ảnh hữu ích. Chỉ riêng độ tương phản pha đôi khi không thành công trong những trường hợp như vậy vì đế buồng cong hoạt động giống như một thấu kính và làm suy yếu sự chồng chất của các vòng pha. Một thanh trượt chứa hai trong số các khu vực được đề cập để cho phép thực hiện chiếu sáng từ bên trái hoặc bên phải, theo yêu cầu. Điều này giúp có thể đối chiếu các tế bào ngay cả gần các cạnh của các lỗ trong các tấm microtiter.

Chiếu sáng trường tối

Phương pháp xung quanh kính hiển vi trường tối, mặc dù được sử dụng rộng rãi để chụp ảnh các mẫu vật trong suốt trong suốt Thế kỷ 19 và 20, nhưng lại bị hạn chế sử dụng cho các tế bào và sinh vật bị cô lập về mặt vật lý (như được trình bày trong Hình 1(e)). Trong kỹ thuật này, tụ quang hướng một hình nón ánh sáng vào mẫu vật ở các góc phương vị cao sao cho các mặt sóng bậc một không đi trực tiếp vào thành phần thấu kính phía trước vật kính. Ánh sáng đi qua mẫu vật bị nhiễu xạ, phản xạ và/hoặc khúc xạ bởi sự gián đoạn quang học (chẳng hạn như màng tế bào, nhân và các bào quan bên trong) cho phép các tia yếu này đi vào vật kính. Mẫu vật sau đó có thể được hình dung như một vật thể sáng trên nền đen. Thật không may, ánh sáng tán xạ bởi các vật thể bị loại bỏ khỏi mặt phẳng tiêu cự cũng góp phần tạo nên hình ảnh, do đó làm giảm độ tương phản và che khuất chi tiết mẫu vật. Hiện tượng này được kết hợp bởi thực tế là bụi và mảnh vụn trong buồng tạo ảnh cũng góp phần đáng kể vào hình ảnh thu được. Hơn nữa, các tế bào kết dính mỏng thường chịu tín hiệu rất yếu, trong khi các mô thực vật và động vật dày chuyển hướng quá nhiều ánh sáng vào đường dẫn mục tiêu, làm giảm hiệu quả của kỹ thuật.

Gần đây, một mối quan tâm mới đối với kính hiển vi trường tối truyền qua đã nảy sinh do những ưu điểm của nó khi được sử dụng kết hợp với kính hiển vi huỳnh quang. Kính hiển vi trường tối là một kỹ thuật chiếu sáng chuyên dụng tận dụng sự chiếu sáng xiên, như đã mô tả ở trên, để tăng cường độ tương phản trong các mẫu vật không được chụp ảnh tốt trong điều kiện chiếu sáng trường sáng bình thường. Một nền tối nhân tạo được tạo ra trong kính hiển vi bằng cách sử dụng một điểm dừng hình khuyên trong tụ quang (xem Hình 8). Mặc dù quang học tụ quang sau đó chiếu sáng mẫu, nhưng chúng làm như vậy với một hình nón ngược rỗng của ánh sáng đi qua mẫu vật ở các góc cực xiên ở tất cả các phương vị để chỉ ánh sáng tương tác với các đặc điểm của mẫu vật mới có thể đi vào vật kính của kính hiển vi để tạo thành một hình ảnh sáng của mẫu vật được đặt chồng lên trên nền tối. Để tạo ra các góc cao, khẩu độ vật kính cần phải nhỏ hơn khẩu độ bên trong của nón ánh sáng chiếu sáng (xem Hình 8(a)). Tuy nhiên, các vật kính có màng chắn mống mắt biến đổi được tích hợp cũng có sẵn để chặn ánh sáng gián tiếp ngay cả khi nó rơi vào hình nón khẩu độ của vật kính (như minh họa trong Hình 8(b)). Điều này cho phép sử dụng khẩu độ rất cao để chiếu sáng trường tối. Kính hiển vi Darkfield là một công cụ tuyệt vời cho các nghiên cứu sinh học và y học. Nó có thể được sử dụng hiệu quả ở độ phóng đại cao để chụp ảnh vi khuẩn sống hoặc ở độ phóng đại thấp để xem và chụp ảnh các tế bào, mô và toàn bộ cơ thể. các vật kính có màng chắn mống mắt có thể thay đổi tích hợp cũng có sẵn để chặn ánh sáng gián tiếp ngay cả khi nó rơi vào hình nón khẩu độ của vật kính (như minh họa trong Hình 8(b)). Điều này cho phép sử dụng khẩu độ rất cao để chiếu sáng trường tối. Kính hiển vi Darkfield là một công cụ tuyệt vời cho các nghiên cứu sinh học và y học. Nó có thể được sử dụng hiệu quả ở độ phóng đại cao để chụp ảnh vi khuẩn sống hoặc ở độ phóng đại thấp để xem và chụp ảnh các tế bào, mô và toàn bộ cơ thể. các vật kính có màng chắn mống mắt có thể thay đổi tích hợp cũng có sẵn để chặn ánh sáng gián tiếp ngay cả khi nó rơi vào hình nón khẩu độ của vật kính (như minh họa trong Hình 8(b)). Điều này cho phép sử dụng khẩu độ rất cao để chiếu sáng trường tối. Kính hiển vi Darkfield là một công cụ tuyệt vời cho các nghiên cứu sinh học và y học. Nó có thể được sử dụng hiệu quả ở độ phóng đại cao để chụp ảnh vi khuẩn sống hoặc ở độ phóng đại thấp để xem và chụp ảnh các tế bào, mô và toàn bộ cơ thể.

Kính hiển vi ánh sáng phân cực

Kính hiển vi ánh sáng phân cực là một kỹ thuật tăng cường độ tương phản giúp cải thiện đáng kể chất lượng hình ảnh thu được bằng vật liệu lưỡng chiết khi so sánh với các kỹ thuật khác như chiếu sáng trường sáng và trường tối, tương phản pha, tương phản nhiễu vi sai, huỳnh quang và tương phản điều chế Hoffman. Kính hiển vi ánh sáng phân cực có độ nhạy cao và có thể được sử dụng cho cả nghiên cứu định tính và định lượng nhắm vào nhiều loại mẫu vật dị hướng. Kính hiển vi phân cực định tính khá phổ biến trong thực tế, tuy nhiên, các khía cạnh định lượng của kính hiển vi ánh sáng phân cực, chủ yếu được áp dụng trong tinh thể học, đại diện cho một chủ đề khó hơn nhiều, chủ yếu được sử dụng bởi các nhà khoáng vật học, nhà địa chất và nhà hóa học

Kính hiển vi ánh sáng phân cực (Hình 1(f)) được thực hiện bằng cách quan sát mẫu giữa các phần tử phân cực chéo được đưa vào hệ thống quang học trước tụ quang và sau vật kính. Các tập hợp bên trong tế bào có đặc tính lưỡng chiết, chẳng hạn như thành tế bào thực vật, hạt tinh bột và thoi phân bào, cũng như mô cơ, làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, xuất hiện sáng trên nền tối. Mô cơ thỏ được minh họa trong Hình 1(f) là một ví dụ về kính hiển vi ánh sáng phân cực được áp dụng để quan sát mô sống. Lưu ý rằng kỹ thuật này bị hạn chế bởi sự xuất hiện của hiện tượng lưỡng chiết trong tế bào và mô sống và vẫn chưa được khám phá đầy đủ. Như đã đề cập ở trên, độ tương phản giao thoa chênh lệch hoạt động bằng cách đặt một cặp lăng kính Nomarski đối nhau phù hợp giữa các bản phân cực chéo, do đó, bất kỳ kính hiển vi nào được trang bị cho quan sát DIC cũng có thể được sử dụng để kiểm tra mẫu vật trong ánh sáng phân cực phẳng chỉ bằng cách loại bỏ các lăng kính khỏi quang học .

Có hai phần tử phân cực trong kính hiển vi phân cực (xem Hình 9). Bản phân cực đầu tiên được đặt bên dưới bệ mẫu với phương vị dao động của nó được cố định theo hướng Đông-Tây. Lưu ý rằng hầu hết các yếu tố này trong kính hiển vi thương mại có thể xoay 360 độ. Một phân cực khác (máy phân tích), thường được căn chỉnh theo hướng rung theo hướng Bắc-Nam (nhưng lại có thể xoay được trên một số kính hiển vi), được đặt phía trên vật kính và có thể di chuyển vào và ra khỏi đường ánh sáng khi cần. Khi cả máy phân cực và máy phân tích được lắp vào đường quang, góc phương vị rung của chúng được định vị vuông góc với nhau. Trong cấu hình này, kính phân cực và máy phân tích được giao nhau, không có ánh sáng đi qua hệ thống quang học và nền tối hiện diện trong thị kính (Hình 9(a)). Sóng ánh sáng phân cực tuyến tính được tạo ra bởi các bộ phân cực lọc ra một mặt phẳng đặc quyền khỏi sự nhầm lẫn thống kê của các hướng dao động phổ biến trong ánh sáng tự nhiên. Hai thành phần trực giao của ánh sáng (sóng thường và sóng bất thường) di chuyển với tốc độ khác nhau qua mẫu vật và kết quả là quan sát thấy các chiết suất khác nhau, một hiện tượng được gọi làlưỡng chiết (bắt nguồn từ các thuật ngữ khúc xạ kép hoặc hai khúc xạ ). Một phép đo định lượng về khả năng lưỡng chiết bằng với hiệu số giữa các chỉ số khúc xạ mặt sóng. Mặt sóng nhanh hơn xuất hiện đầu tiên từ mẫu vật để tạo ra sự khác biệt về đường quang với mặt sóng chậm hơn. Máy phân tích kết hợp lại các thành phần của hai mặt sóng di chuyển cùng hướng và dao động trong cùng một mặt phẳng. Phần tử phân cực này đảm bảo rằng hai mặt sóng có cùng biên độ tại thời điểm tái hợp để có độ tương phản tối đa.

Sự sắp xếp thích hợp để chụp ảnh ánh sáng phân cực tương đối dễ thực hiện trên hầu hết mọi kính hiển vi. Bộ phân cực bên dưới tụ quang (gần màng khẩu độ) đảm bảo rằng mẫu vật được chiếu sáng bằng các mặt sóng phân cực tuyến tính đi qua tụ quang (tham khảo Hình 9(a)). Máy phân tích (máy phân cực thứ hai), được định hướng với góc phương vị được sắp xếp ở một góc 90 độ so với góc phương vị của máy phân cực, được đặt phía sau vật kính. Thấu kính ống tạo thành hình ảnh trung gian, hình ảnh này được chiếu qua thị kính hoặc lên mặt phẳng hình ảnh của máy ảnh. Nếu không có mẫu vật nào được đặt trên bệ kính hiển vi, cảnh quan sát được qua thị kính sẽ hoàn toàn tối. Khi được chiếu sáng, nhiều mẫu vật quay hướng dao động của ánh sáng phân cực ra khỏi mặt phẳng do bản phân cực tạo ra. Những mẫu vật như vậy chủ yếu bao gồm các vật liệu lưỡng chiết, trong đó chỉ số khúc xạ phụ thuộc vào hướng dao động của ánh sáng tới. Điều này chủ yếu xảy ra với tinh thể, chẳng hạn như tinh bột hoặc khoáng chất (Hình 9(c)), nhưng cũng xảy ra với sợi (Hình 9(d)) và polyme. Nếu các vật liệu như vậy được xem dưới kính hiển vi phân cực giữa bản phân cực chéo và máy phân tích, thì có thể nhìn thấy các vùng sáng trong ảnh do ánh sáng được truyền một phần bởi máy phân tích.

Hệ thống quang học của kính hiển vi ánh sáng phân cực cũng có thể bao gồm một phần tử phụ trợ được gọi là lambda hoặc độ trễ tấm (Hình 9(a) và 9(b)) được sử dụng trong phân tích định lượng. Trong ánh sáng phân cực, tấm lambda này chuyển đổi độ tương phản thành màu sắc. Như trong độ tương phản pha, sự khác biệt về đường quang làm phát sinh màu sắc, mặc dù lần này là với ánh sáng phân cực và vật liệu lưỡng chiết trong mẫu vật. Sự khác biệt về đường dẫn được tạo ra dẫn đến sự tuyệt chủng của một số bước sóng nhất định trong ánh sáng thông qua giao thoa (chỉ một số màu nhất định còn lại từ ánh sáng trắng và tạo ra những bức ảnh có màu sắc đẹp mắt). Kính hiển vi phân cực cung cấp một lượng lớn thông tin về thành phần và cấu trúc ba chiều của một loạt các mẫu. Thực tế là không giới hạn trong phạm vi của nó, kỹ thuật này có thể tiết lộ thông tin về lịch sử nhiệt và các biến dạng mà mẫu vật phải chịu trong quá trình hình thành. Có giá trị trong sản xuất và nghiên cứu, kính hiển vi phân cực tương đối rẻ và là một công cụ nghiên cứu và kiểm soát chất lượng

Nguồn: https://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/print/basics/contrast-print.html