Kỹ thuật sinh thiết lạnh (cắt lạnh) từ Leica Biosystems

Bài viết này sẽ đề cập đến quá trình vùi mô cho phần đông lạnh. Mặc dù việc vùi mô là một quá trình đơn giản, nhưng có nhiều mẫu phải phụ thuộc vào định hướng mẫu trong khối để đưa ra câu trả lời chính xác.

Trong máy cắt lạnh thông thường, mô được vùi vào phần đông lạnh bằng cách đặt nó ngửa lên trên giá đỡ mô và được phủ một lớp dung dịch. Sau đó, giá đỡ mô được đặt trên thanh nhiệt độ đóng băng. Một bộ tản nhiệt đặt trên mô vào thời điểm thích hợp để đẩy nhanh quá trình đông lạnh và làm phẳng bề mặt của mô để tạo ra một mặt phẳng. Hệ thống này còn nhiều thiếu sót, có thể dẫn đến ảnh hưởng đáng kể. Hệ thống hoạt động hiệu quả trong các tình huống có sẵn một lượng lớn mô và định hướng mô chính xác. Một mẫu lớn có thể được vùi và cắt để tạo thành lát cắt hoàn hảo. Tuy nhiên, các phương pháp hiện tại không phù hợp trong một tỷ lệ đáng kể các trường hợp cần có độ chính xác cao và khả năng dự đoán của bề mặt mô đã chuẩn bị. Kết quả có thể là các chế phẩm không đạt tiêu chuẩn đòi hỏi phải cắt bỏ và tiêu hao đáng kể mẫu mô. Sự biến dạng có thể xảy ra do mô bị nghiền nát bởi máy ép nhiệt có trọng số.

Đối với các mẫu mô nhỏ và mỏng, có thể khó lấy được những lát cắt mong muốn hay định hướng chính xác. Việc đặt các mẫu này trong môi trường vùi mô lạnh và đặt từng mẫu vào đúng vị trí mang lại cảm giác không thoải mái cho người sử dụng.

Các nhà công nghệ mô học nhiều kinh nghiệm đã tìm ra nhiều kỹ thuật và thiết bị tạm thời nhằm cố gắng đạt được kết quả tối ưu. Một trong những kỹ thuật như vậy là sử dụng mâm cặp đã đông lạnh trước được phủ một lớp môi trường vùi mô. Điều này giúp mô có một bề mặt phẳng để đứng chứ không phải là các lưới và rãnh không đều được thiết kế để giữ chặt mô và môi trường đông lạnh tạo thành mặt của mâm cặp. Những người khác sẽ làm phẳng các mô trên bề mặt đông lạnh trước khi vùi mô vào mâm cặp. Các nhà công nghệ mô học trong lĩnh vực phẫu thuật Mohs sẽ sử dụng kỹ thuật rạch mẫu vật để có thể dễ dàng làm phẳng hơn.

Quá trình cắt đông lạnh rất khắt khe để mang lại kết quả nhanh chóng. Khó khăn sẽ tăng lên khi nhiều bác sĩ phẫu thuật đưa nhiều mẫu xét nghiệm cùng một lúc. Sử dụng thiết bị cắt lạnh hiện đại, có thể mất 90 giây hoặc hơn để làm lạnh một khối, trong thời gian đó chúng ta phải theo dõi quá trình làm lạnh trong thời gian thích hợp để đặt bộ chiết tách gia nhiệt lên khối lạnh. Để tăng tốc quá trình, một số tổ chức đã chuyển sang các phương pháp thay thế để làm đông lạnh nhanh các mô, chẳng hạn như ngâm mô vào nitơ lỏng hoặc các chất lỏng siêu lạnh khác. Quá trình nhanh chóng này mang lại ít hiện tượng đông lạnh hơn nhưng độ chính xác bị hạn chế.

Một số sự đổi mới đã nhận ra những hạn chế với các phương pháp thông thường và đã đưa ra thị trường các phương tiện thay thế để vùi mô cho phần đông lạnh. Chúng bao gồm các thiết bị khác nhau, từ các thiết bị làm phẳng đơn giản đến các dụng cụ phức tạp và phức tạp với hy vọng cung cấp cho người dùng một phương tiện rõ ràng hơn để đạt được sự định hướng thích hợp của các mô.

Bài viết này mô tả một hệ thống bao gồm một thiết bị đơn giản và các kỹ thuật được sử dụng để nhúng mô cho phần đông lạnh. Hệ thống vùi mô bằng cách sử dụng các giếng nhiệt độ đông lạnh được gia công vào bề mặt của các thanh thép. Mặc dù tương tự như việc vùi parafin, hệ thống này có một ưu điểm khác biệt. Ưu điểm này là đặc tính vật lý khiến mô dính vào thép đông cứng. Đặc tính này tạo điều kiện thuận lợi cho việc đưa mô vào các giếng và dễ dàng hơn so với mô đứng trong quá trình đông lạnh parafin. Những ưu điểm sẽ được nêu trong bài viết này bao gồm độ chính xác, khả năng dự đoán, tốc độ và giảm lãng phí mô, dễ thực hiện, thoải mái và thuận tiện.

Vùi mô vào các giếng

Việc vùi mô được thực hiện trong các giếng được gia công vào mặt các thanh thép không gỉ dày 1 inch (Hình 1A). Khi được làm lạnh, những thanh này cung cấp khả năng tản nhiệt mạnh mẽ để đông lạnh nhanh chóng. Giếng được gia công với thành vát, các cạnh được bo tròn, bề mặt được đánh bóng để dễ dàng tháo lắp. Ở dạng hiện tại, tác giả sử dụng các giếng hình vuông có các góc tròn có đường kính 18, 24 và 30 mm ngang đáy. Giếng có kích thước và độ sâu khác nhau có thể được chế tạo để phù hợp với các tình huống khác nhau. Các thanh giếng được lưu trữ ở điểm thuận tiện sâu nhất trong máy cắt lạnh, nơi có nhiệt độ thấp nhất và được đưa đến vị trí cao hơn hoặc dễ tiếp cận hơn trong quá trình vùi mô. Nhiệt độ điều hòa xung quanh từ -23 đến -27 °C hoạt động lý tưởng để làm đông lạnh nhanh chóng.

Mâm cặp

Đầu cặp được thiết kế với dạng lưới chéo gồm các rãnh được cắt sắc nét để tối đa hóa lực kẹp cần thiết để giữ khối mô vùi (Hình 1B). Chiều rộng và chiều sâu của các kênh cho phép sự thâm nhập hoàn toàn của môi trường vùi mô khi sử dụng lạnh và do đó có thể được bảo quản ở nhiệt độ đông lạnh để tạo điều kiện đông lạnh nhanh chóng. Kiểu lưới chéo cho phép đùn vật liệu vùi dư để mâm cặp có thể được ép phẳng vào mặt thanh giếng. Đầu cặp được làm bằng thép không gỉ, tối đa hóa khả năng đóng băng và độ bền của chúng, đồng thời được bảo quản trong thùng ở vị trí thuận tiện thấp trong bộ điều hòa nhiệt độ. Đầu cặp đông lạnh tối ưu khi sử dụng lạnh nhưng cũng có thể được sử dụng ở nhiệt độ nóng bằng cách sử dụng khối cấp đông quá đầu cặp được mô tả dưới đây.

Khối lạnh Over-Chuck

Khối đông lạnh có mâm cặp được làm bằng thép hình chữ nhật có chức năng như một bộ phận hút nhiệt (Hình 1C). Chúng được thiết kế để vừa với thân mâm cặp, gõ nhẹ vào mâm cặp sẽ tách mặt phẳng bám dính, giữ khối đã tạo hình vào giếng. Những khối này cũng đóng vai trò như một bề mặt đóng băng phẳng thuận tiện, hữu ích trong kỹ thuật trát được thảo luận dưới đây.

Các tiêu bản

Tiêu bản trong suốt được làm bằng nhựa vinyl và dùng để định hướng chính xác mô vào vị trí mong muốn và là phương tiện để chuyển mô chính xác đến giếng vùi mô (Hình 1D) . Mô được gắn vào tiêu bản trong suốt để có thể nhìn thấy nó từ bên dưới. Bề mặt có thể nhìn thấy được sẽ được đặt trên giếng và cuối cùng sẽ là bề mặt vùi được cắt.

Giá đỡ vùi mô

Giá đỡ vùi mô có thể tháo rời được thiết kế bên dưới lỗ mở của máy cắt lạnh ở vị trí thuận tiện và thoải mái nhất về mặt công thái học (Hình 1E). Các giá đỡ được làm với nhiều kích cỡ khác nhau để chứa hầu hết các dụng cụ. Giá đỡ trong hình chứa ba thanh giếng có khả năng vùi 12 khối.

Tiêu bản

Tiêu bản thu hẹp theo chiều rộng đầu khác nhau. Chiều rộng của đầu được chọn dựa trên kích thước mô và kích thước giếng nơi mô được đặt. Tiêu bản sẽ cung cấp cái nhìn tổng quan về mô được đặt xuống sàn giếng. Trong khi nhìn qua mặt sau của tiêu bản, mô có thể được điều chỉnh theo hướng chính xác mong muốn.

Điều này có thể làm cho lớp biểu bì hoặc rìa có thể nhìn thấy được hoặc để đặt mô lên trên mép. Sau đó, khi lấy mô ra khỏi tiêu bản, nó sẽ được hướng dẫn để bám vào vị trí mong muốn.

Một lớp môi trường vùi mô mỏng đảm bảo khối được giải phóng dễ dàng và sạch sẽ và đảm bảo độ bám dính của mô với sàn giếng. Lớp môi trường này cũng cung cấp sự hỗ trợ cho mô, hỗ trợ thao tác trên tiêu bản và tạo độ bám dính cho tiêu bản trong quá trình vận chuyển. Nếu sử dụng quá nhiều dung dịch môi trường thì sẽ có một lớp đông lạnh dày hơn. Đây là vấn đề khi yêu cầu độ phẳng cực cao, chẳng hạn như khi vùi nhiều mẫu nhỏ hoặc sinh thiết bằng kim phẳng. Hình 3 thể hiện một ví dụ kỹ thuật yêu cầu vùi mô cực kỳ phẳng. Các mẫu trong trường hợp này là hạt vừng có màu. Điều này không thể thực hiện được nếu không sử dụng một lớp môi trường rất mỏng để dính các hạt vừng vào sàn giếng.

Nếu không có nguy cơ lây nhiễm chéo, một số mẫu mô có thể được đặt trên một tiêu bản duy nhất và kéo đến cuối để đặt vào một hoặc nhiều giếng. Ví dụ, khi lấy mẫu một khối u lớn, bốn ô vuông 1 cm có thể được đặt vào một giếng 30 mm. Điều này cho phép lấy mẫu một lượng mô khá lớn từ một khối cắt đơn. Tuy nhiên, nếu người ta đang xem xét các mẫu vật riêng biệt, chẳng hạn như hạch bạch huyết từ bốn vị trí khác nhau, thì phải sử dụng các tiêu bản phân phối riêng biệt để tránh lây nhiễm chéo.

Đặt mô vào giếng

Hướng và vị trí của mô trong giếng cần được xem xét trước khi đặt mô. Ví dụ: nếu một mô dài 2 cm được đặt đặt trong giếng 30 mm, cần đặt bắt đầu từ gần mép thay vì ở giữa. Nếu bốn ô vuông 1 cm được đặt trong giếng 30 mm, chúng phải được đặt vuông góc ở các góc để có khoảng trống (Hình 4). Như trong tất cả quá trình chuẩn bị phần đông lạnh, cần xem xét hướng của mô với lưỡi dao.

Quá trình kéo tiêu bản ra khỏi mô có thể đòi hỏi độ chính xác cao để đạt được kết quả cuối cùng. Trong các mẫu không cần định hướng, tiêu bản có thể được kéo ra một cách nhanh chóng. Trong các mẫu yêu cầu định hướng chính xác, quá trình này có thể được thực hiện chậm hơn và tỉ mỉ hơn. Nếu hình dạng của mẫu cho phép, cạnh quan trọng nhất của mẫu phải được đặt xuống trước tiên. Sau đó, tiêu bản có thể được kéo ra từ từ bên dưới mẫu một cách cẩn thận bằng cách sử dụng kẹp để dẫn hướng vùng quan trọng bám chặt vào thép theo hướng mong muốn. Nếu phần lề có dấu mực đang được kiểm tra, có thể cẩn thận hơn để đảm bảo rằng phần lề được dán trước tiên, sau đó phần còn lại có thể được xử lý. Trong một dải da mỏng từ ca phẫu thuật Mohs, có thể phải hết sức cẩn thận để đảm bảo lớp biểu bì được nhìn thấy hoàn toàn và mẫu vật được vùi phẳng. Các mẫu cần làm phẳng cực độ có thể được ép phẳng bằng phần dưới của một chiếc kẹp có góc cạnh. Các ống, chẳng hạn như bờ niệu quản, có thể dễ dàng chạm vào để bám vào sàn giếng theo hướng thẳng đứng. Các dải mỏng có thể được định hướng để cạnh bám chặt vào hướng của cạnh. Các mảnh màng có thể được cuộn hoặc gấp lại để đứng trên mép của tiêu bản phân phối và được kéo ra và vùi theo cùng một hướng.

Xử lý chất lỏng

Các chất lỏng và các mẫu rất mềm, chẳng hạn như dụng cụ nạo nội mạc tử cung, có thể được cạo bằng thìa hoặc thìa nhựa và đặt ngay ngắn vào giếng mà không bị nghiền nát (Hình 5A và 5B) . Đối với các mẫu chất lỏng có nhiều máu, việc khuấy thêm một vài giọt dung dịch sẽ giúp phần cắt có máu ít bị vỡ hơn. Hình 6 cho thấy một ví dụ về độ chính xác có thể xử lý chất lỏng khi sử dụng hệ thống này.

Đổ đầy giếng bằng dung dịch và đặt mâm cặp

Phải có một mặt khum phồng lên của vật liệu vùi môđể xuyên qua các rãnh ở mặt mâm cặp để liên kết chắc chắn với khối tạo hình. Mâm cặp phải được đặt trên giếng càng nhanh càng tốt sau khi đổ đầy. Mâm cặp được đặt bằng cách ấn chặt mặt mâm cặp vào bề mặt thanh giếng.

Thời gian đông lạnh 

Thời gian đông lạnh được khuyến nghị là thời gian gần đúng mà nhà giải phẫu đã trải qua khi các thanh giếng và mâm cặp được làm lạnh hoàn toàn. Thời gian đông lạnh sẽ tăng lên nếu các thanh giếng được làm nóng, nếu mâm cặp được sử dụng ở nhiệt độ nóng hoặc nếu mẫu rất dày. Người dùng nhanh chóng phát triển cảm giác khi khối đã sẵn sàng. Các thanh giếng phải được đưa trở lại mức thấp hơn của máy cắt lạnh ngay sau khi tháo mâm cặp ra để duy trì nhiệt độ tối ưu. Đầu kẹp phải được làm sạch, sấy khô và thay thế trong máy cắt lạnh càng sớm càng tốt để đạt hiệu suất tối đa.

Xử lý nhiều mẫu vật

Khi phải đối mặt với nhiều mẫu vật, hệ thống này có khả năng xử lý nhiều khối rất nhanh chóng. Việc phân phối các tiêu bản phải được chuẩn bị trước nhằm cố gắng giữ các tiêu bản và mẫu thử theo thứ tự trước khi đổ đầy giếng. Các mâm cặp dễ dàng được dán nhãn sau khi chúng được đặt trên giếng. Nếu mâm cặp được làm lạnh hoàn toàn, các khối có thể được lấy ra khỏi giếng trong khoảng 15 giây trước khi quá trình đông lạnh hoàn tất. Quá trình đông lạnh được hoàn thành trên bất kỳ bề mặt đông lạnh nào trong khi các khối bổ sung được chuẩn bị. Trong thời gian lấp đầy bốn giếng, những giếng đầu tiên đã đầy có thể được loại bỏ và các mẫu bổ sung được đặt vào các giếng trống. Vào thời điểm người tập sẵn sàng cắt các khối, chúng sẽ đông cứng hoàn toàn. Tám khối có thể được đông lạnh trong vòng chưa đầy 2 phút.

Xoá khối

Chạm mạnh vào mâm cặp bằng cách sử dụng khối đông lạnh trên mâm cặp sẽ dễ dàng giải phóng các khối. Mũi nhọn gây ra sự phân tách trong mặt phẳng liên kết hình thành giữa thép nguội và môi trường đông lạnh. Các khối sẽ tự do nguyên vẹn ngay cả khi bị đóng băng không hoàn toàn, miễn là bề mặt bên dưới mâm cặp đã có thời gian đóng băng đối với mâm cặp.

Nếu mâm cặp bị tuột ra, đó có thể là kết quả của việc đổ đầy môi trường vào giếng hoặc sử dụng mâm cặp nóng mà không có khối đông lạnh mâm cặp quá mức. Có thể sửa chữa nhanh chóng, dễ dàng bằng cách thêm một lớp vật liệu vùi mô bổ sung và mâm cặp mới.

Thạch cao

Kỹ thuật trát vữa được sử dụng để sửa chữa bất kỳ lỗ hổng, lỗi hoặc kẽ hở nào gặp phải trên bề mặt của khối được chuẩn bị bằng hệ thống này hoặc các phương pháp thông thường (Hình 7). Đôi khi, một khoảng trống co lại nhỏ có thể hình thành trên bề mặt của khối giữa môi trường phủ mô và môi trường lấp đầy giếng. Khoảng này sẽ nhanh chóng bị cắt bỏ khi hình thành bề mặt khối. Trong những mẫu nhỏ chỉ cần cắt tỉa ở mức tối thiểu cho phép, quy trình trát sẽ lấp đầy mọi khuyết điểm trong vài giây. Việc lấp đầy các lỗ phát sinh từ bong bóng trong dung dịch hoặc lỗi còn sót lại sau khi tháo ghim không mong muốn khỏi khối sẽ cải thiện khả năng có được một phần hoàn chỉnh. Hình 7A cho thấy một ví dụ về những bất thường trên bề mặt có thể thấy trong khối đông lạnh vùi lạnh nhanh chóng được lấp đầy bằng thạch cao. Kỹ thuật trát được thực hiện như sau:

1. Nhỏ một giọt dung dịch lên bất kỳ lỗi nào trên mặt khối (Hình 7B).
2. Nhấn mặt khối vào bề mặt đông lạnh (Hình 7C)
3. Giải phóng khối bằng cách chạm hoặc kéo (Hình 7D).

Môi trường có thể được sử dụng dưới dạng nhỏ giọt từ chai, bôi một lớp mỏng bằng ngón tay, cạnh thẳng của bìa cứng hoặc bất kỳ thiết bị nào hoạt động như một con dao trát. Nếu quá trình cắt đã bắt đầu, quá trình này có thể được thực hiện trong khi khối nằm trong giá đỡ bằng cách bôi môi trường lên mặt khối và sau đó ấn khối đông lạnh.

Định hướng mô vào dao

Đây là một khía cạnh cực kỳ quan trọng của việc chuẩn bị phần đông lạnh. Bằng cách sử dụng hệ thống vùi mô được mô tả trong bài viết này, việc chuẩn bị và định hướng các mô trong giếng khá dễ dàng để dao tiếp xúc với mô theo một hướng cụ thể. Dựa trên kinh nghiệm, các quy tắc chung sau đây được áp dụng:

1. Mỡ phải là thứ cuối cùng chạm vào lưỡi dao (Hình 8A và B). Chất béo không đủ cứng để cắt tốt ở nhiệt độ tốt nhất để cắt hầu hết các loại mô khác. Khi mỡ chạm vào lưỡi dao trước các mô dễ quản lý hơn, nó có thể làm hỏng phần còn lại.
2. Cạnh quan trọng nhất của mô phải vuông góc hoặc chéo với lưỡi dao chứ không phải là mặt đầu tiên hoặc cuối cùng của mô tiếp xúc với lưỡi dao.
3. Các mô lót biểu mô và niêm mạc như da và đường tiêu hóa, bàng quang, tử cung và cổ tử cung phải được định hướng với mặt phẳng biểu mô vuông góc với lưỡi dao. Khi nhúng một hình elip vào da, phần cuối tiếp xúc với lưỡi dao trước tiên có xu hướng cong lại. Sơ đồ trong Hình 9 cho thấy cách tiếp cận để vùi mô da hình elip nhỏ, sao cho các lề dọc (2-5) sẽ chạm vào lưỡi dao cuối cùng.