Giới thiệu
Huỳnh quang là tính năng quan trọng trong quá trình phát quang của kính hiển vi, trong đó các phân tử nhạy cảm phát ra ánh sáng từ trạng thái kích thích điện tử được tạo ra bởi cơ chế vật lý (ví dụ, hấp thụ ánh sáng), cơ học (ma sát) hoặc cơ chế hóa học. Sự tạo ra sự phát quang thông qua sự kích thích của một phân tử bằng các photon ánh sáng cực tím hoặc khả kiến là một hiện tượng được gọi là phát quang, được chia chính thức thành hai loại, huỳnh quang và lân quang , tùy thuộc vào cấu hình điện tử của trạng thái kích thích và đường phát xạ. Huỳnh quang là đặc tính của một số nguyên tử và phân tử để hấp thụ ánh sáng ở một bước sóng cụ thể và sau đó phát ra ánh sáng có bước sóng dài hơn sau một khoảng thời gian ngắn, gọi là thời gian sống huỳnh quang. Quá trình lân quang xảy ra theo cách tương tự như huỳnh quang, nhưng có thời gian tồn tại ở trạng thái kích thích dài hơn nhiều.
Quá trình phát huỳnh quang bị chi phối bởi ba sự kiện quan trọng, tất cả đều xảy ra trong khoảng thời gian cách nhau vài bậc độ lớn (xem Hình 1(a)). Sự kích thích của một phân tử nhạy bởi một photon tới xảy ra trong femto giây (10± 15 giây), trong khi sự dao động thư giãn của các electron ở trạng thái kích thích đến mức năng lượng thấp nhất chậm hơn nhiều và có thể đo bằng pico giây (10 ±12 giây). Quá trình cuối cùng, phát xạ một photon có bước sóng dài hơn và đưa phân tử trở về trạng thái cơ bản, xảy ra trong khoảng thời gian tương đối dài tính bằng nano giây (10,9 giây ). Mặc dù toàn bộ thời gian tồn tại của huỳnh quang phân tử, từ khi kích thích đến khi phát xạ, chỉ được đo bằng phần tỷ giây, nhưng hiện tượng này là một biểu hiện đáng kinh ngạc về sự tương tác giữa ánh sáng và vật chất, tạo cơ sở cho trường mở rộng của trạng thái ổn định và huỳnh quang phân giải theo thời gian. quang phổ và kính hiển vi. Do cấu hình phát xạ cực kỳ nhạy, độ phân giải không gian và độ đặc hiệu cao của nghiên cứu huỳnh quang, kỹ thuật này đã trở thành một công cụ quan trọng (phim hoạt hình trong Hình 1(b)) trong di truyền học và sinh học tế bào.
Một số nhà nghiên cứu đã báo cáo hiện tượng phát quang trong thế kỷ 17 và 18, nhưng chính nhà khoa học người Anh Sir George G. Stokes là người đầu tiên mô tả huỳnh quang vào năm 1852 và là người đặt ra thuật ngữ này để vinh danh khoáng chất huỳnh quang trắng xanh (fluorit). Stokes còn phát hiện ra sự dịch chuyển bước sóng đến các giá trị dài hơn trong quang phổ phát xạ mang tên ông (được gọi là Sự dịch chuyển Stokes ; Hình 1(c) và Hình 2). Huỳnh quang lần đầu tiên được quan sát thấy trong kính hiển vi huỳnh quang vào đầu thế kỷ 20 bởi một số nhà khoa học nổi tiếng. Kính hiển vi huỳnh quang đầu tiên được phát triển từ năm 1911 đến năm 1913 bởi các nhà vật lý người Đức Otto Heimstaedt và Heinrich Lehmann như một sản phẩm phụ của thiết bị tia cực tím. Những kính hiển vi này được sử dụng để quan sát quá trình tự phát huỳnh quang ở mô vi khuẩn, động vật và thực vật. Ngay sau đó, Stanislav Von Provazek đã mở ra một kỷ nguyên mới khi ông sử dụng kính hiển vi huỳnh quang để nghiên cứu khả năng liên kết thuốc nhuộm trong các mô cố định và tế bào sống. Tuy nhiên, phải đến đầu những năm 1940, Albert Coons mới phát triển được kỹ thuật dán nhãn kháng thể bằng thuốc nhuộm huỳnh quang, từ đó khai sinh ra lĩnh vực miễn dịch huỳnh quang. Vào đầu thế kỷ 21, lĩnh vực kính hiển vi huỳnh quang đã tạo ra một cuộc cách mạng trong sinh học tế bào, kết hợp sức mạnh của hình ảnh tế bào sống với khả năng ghi nhãn đa dạng có tính đặc hiệu cao của các bào quan và phức hợp phân tử riêng lẻ bằng đầu dò huỳnh quang tổng hợp và được mã hóa di truyền.
Cấu hình bộ lọc kính hiển vi huỳnh quang
Đặc điểm cơ bản của bất kỳ kính hiển vi huỳnh quang nào là cung cấp cơ chế kích thích mẫu vật với ánh sáng được lọc có chọn lọc, sau đó cách ly phát xạ huỳnh quang yếu hơn nhiều bằng bộ lọc thứ hai để cho phép hình thành hình ảnh trên nền tối với độ nhạy tối đa. Nồng độ đầu dò cục bộ trong mẫu vật sinh học trong nhiều thí nghiệm thấp đến mức chỉ một phần nhỏ ánh sáng kích thích được hấp thụ bởi các loại huỳnh quang. Hơn nữa, trong số các chất huỳnh quang có khả năng hấp thụ một lượng ánh sáng nhất định, tỷ lệ phát ra huỳnh quang thứ cấp thậm chí còn thấp hơn. Mức độ sáng phát xạ huỳnh quang thu được sẽ nằm trong khoảng từ ba đến sáu bậc độ lớn nhỏ hơn mức độ chiếu sáng. Do đó, vấn đề cơ bản trong kính hiển vi huỳnh quang là tạo ra sự chiếu sáng hiệu quả cao cho mẫu vật, đồng thời thu được sự phát xạ huỳnh quang yếu được tách biệt hiệu quả khỏi dải chiếu sáng mạnh hơn nhiều. Những điều kiện này được đáp ứng trong các thiết bị huỳnh quang hiện đại nhờ sự kết hợp của các bộ lọc phối hợp các yêu cầu kích thích và phát xạ dựa trên hoạt động và tính chất của bộ tách chùm lưỡng sắc.
Bảng 1: Màu quang phổ so với dải bước sóng
Các phân tử huỳnh quang chỉ có thể hấp thụ ánh sáng có phạm vi bước sóng giới hạn được quyết định bởi bản chất và mức độ của các electron được định vị, trải dài từ khoảng 20 đến 100 nanomet (như minh họa trong phổ màu vàng trong Hình 2). Khi mô tả các phân tử huỳnh quang, thuật ngữ fluorochrome dùng để chỉ một phân tử thể hiện huỳnh quang, trong khi fluorophore được sử dụng để xác định một fluorochrome được gắn vào một đối tác liên kết cho phép nó nhắm mục tiêu vào một thực thể sinh học cụ thể. Ba thông số cơ bản thường được sử dụng để mô tả và so sánh các chất huỳnh quang là hệ số mol (ε), hiệu suất lượng tử (Φ) và tuổi thọ huỳnh quang (τ). Hệ số mol được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực quang phổ, kính hiển vi và huỳnh quang để chuyển đổi đơn vị độ hấp thụ thành đơn vị nồng độ mol cho nhiều loại chất hóa học. Hệ số tắt được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng tham chiếu (đặc điểm của phân tử hấp thụ) đối với nồng độ một mol (M) (một mol trên lít) của hóa chất mục tiêu trong cuvet có chiều dài đường truyền một centimet. Bước sóng tham chiếu thường là bước sóng có độ hấp thụ cực đại trong phần tử ngoại hoặc phần khả kiến của quang phổ ánh sáng. Mỗi loại fluorochrome hoặc fluorophores khác nhau thể hiện phổ hấp thụ và phát xạ riêng (Hình 2), tùy thuộc vào cấu trúc bên trong của các phân tử huỳnh quang và đôi khi còn phụ thuộc vào môi trường xung quanh chúng. Hơn nữa, không phải mọi photon đều được hấp thụ và phát xạ lại một cách hiệu quả dưới dạng bức xạ có bước sóng dài hơn (màu quang phổ so với màu cảm nhận được liệt kê trong Bảng 1). Tỷ lệ phần trăm photon phát ra so với số lượng photon được hấp thụ là một hằng số đối với mỗi fluorophore được gọi là hiệu suất lượng tử. Cuối cùng, khoảng thời gian mà chất huỳnh quang ở trạng thái kích thích mà không phát ra photon được gọi là thời gian phát huỳnh quang.
Điểm mấu chốt của kính hiển vi huỳnh quang là việc sử dụng các bộ lọc thích hợp để tách ánh sáng kích thích mạnh khỏi sự phát xạ thứ cấp yếu hơn nhiều do fluorophores tạo ra. Thành phần quang học nổi bật trong quá trình lọc huỳnh quang là gương lưỡng sắc, được thiết kế để đặt ở góc 45 độ so với cả ánh sáng tới từ nguồn sáng cũng như trục quang của kính hiển vi, đồng tuyến tính với vật kính và mẫu vật. Ánh sáng từ nguồn (được thảo luận bên dưới) đi qua chuỗi quang học chiếu sáng epi cho đến khi nó chạm tới khối bộ lọc huỳnh quang (xem Hình 2(b)), nơi nó truyền qua bộ lọc kích thích thông dải xác định và sau đó được phản xạ xuống vật kính bằng cách gương lưỡng sắc được tập trung vào mặt phẳng mẫu vật. Ánh sáng được lọc có chọn lọc này được sử dụng để kích thích các chất phát quang có đặc tính quang phổ cho phép chúng hấp thụ ánh sáng trong vùng được cho phép bởi dải thông của bộ lọc kích thích. Sự phát xạ huỳnh quang (ánh sáng này không kết hợp và được phát ra trên một thể tích hình cầu xung quanh chất phát huỳnh quang) được vật kính thu lại và hướng trở lại qua gương lưỡng sắc, gương này phản xạ hầu hết ánh sáng kích thích gây ô nhiễm trở lại nguồn sáng. Các bước sóng phát xạ đi qua gương lưỡng sắc được làm sạch thêm bằng một bộ lọc khác có dải thông xác định, bộ lọc phát xạ , trước khi truyền đến thị kính hoặc mặt phẳng hình ảnh của camera.
Sơ đồ cắt rời của khối bộ lọc huỳnh quang cùng với bản vẽ cấu hình truyền quang phổ của các bộ lọc thành phần được trình bày trong Hình 4 về tổ hợp bộ lọc điển hình được sử dụng để tách sự chiếu sáng kích thích khỏi sự phát xạ huỳnh quang. Phổ của bộ lọc kích thích (Hình 4(a); đường cong màu đỏ) thể hiện mức truyền cao (khoảng 80 phần trăm) trong khoảng từ 460 đến 500 nanomet để kích thích các chất phát huỳnh quang như protein huỳnh quang màu xanh lá cây hoặc fluorescein. Gương lưỡng sắc được đặt theo đường chéo (Hình 4(a); đường cong màu vàng phản xạ các bước sóng trong vùng phổ kích thích, đồng thời truyền các bước sóng cao hơn và thấp hơn với hiệu suất tương đối cao. Sự giảm rõ rệt trong cấu hình truyền của gương lưỡng sắc trong khoảng từ 450 đến 510 nanomet, đại diện cho đỉnh phản xạ, dùng để định hướng các bước sóng trong vùng quang phổ này truyền từ bộ lọc kích thích ở góc 90 độ và tới mẫu vật. Thành phần cuối cùng trong khối bộ lọc, bộ lọc phát xạ hoặc rào cản (Hình 4(a); đường cong màu trắng), là một bộ lọc thông dải khác truyền các bước sóng trong vùng từ 515 đến 565 nanomet, tương ứng với ánh sáng nhìn thấy màu xanh lá cây. Ranh giới giữa các dải bước sóng truyền và phản xạ của các quang phổ xếp chồng khác nhau được thiết kế càng dốc càng tốt để đảm bảo sự phân tách gần như hoàn toàn giữa bước sóng phản xạ và bước sóng truyền. Hiệu suất của sự kết hợp bộ lọc này rất đáng chú ý và nó tạo ra hình ảnh tươi sáng, sắc nét trên nền đen.
Sự phát huỳnh quang của mẫu vật (trong trường hợp này chủ yếu là bước sóng màu xanh lá cây), kết quả từ sự kích thích ánh sáng xanh lục lam, được vật kính thu thập và đi qua gương lưỡng sắc và bộ lọc rào cản. Bộ lọc rào cản được thiết kế đặc biệt để chỉ cho phép ánh sáng có bước sóng trong khoảng từ 515 đến 565 nanomet đi tới thị kính và/hoặc máy dò của kính hiển vi. Để thực hiện nhiệm vụ này, bộ lọc rào cản ngăn chặn một cách hiệu quả các bước sóng ánh sáng kích thích do mẫu phản xạ tới máy dò. Tuy nhiên, phần lớn các bước sóng kích thích quay trở lại từ mẫu vật được phản xạ tới bộ lọc kích thích và đèn chiếu sáng bằng gương lưỡng sắc. Hiệu quả thực sự của cấu hình bộ lọc được minh họa trong Hình 4(b) là tách ánh sáng kích thích, có cường độ cao hơn đáng kể, khỏi sự phát xạ huỳnh quang yếu hơn nhiều, như đã thảo luận ở trên. Điểm quan trọng nhất cần nhớ là mức giới hạn của các bộ lọc liên quan đến kính hiển vi huỳnh quang không phải là tuyệt đối mà cho phép một số ánh sáng nằm ngoài phạm vi bước sóng truyền qua. Các tổ hợp bộ lọc chứa một phiên bản chuyên dụng của gương lưỡng sắc, được gọi là gương đa sắc, cho phép sử dụng nhiều bộ lọc phát xạ và kích thích thông dải để chụp ảnh đồng thời hai hoặc nhiều loại huỳnh quang.
Nguồn sáng cho kính hiển vi huỳnh quang
Việc cân nhắc chính trong việc lựa chọn nguồn sáng cho kính hiển vi huỳnh quang là sự phân bố quang phổ liên quan đến hiệu suất lượng tử và sự hấp thụ của chất huỳnh quang đang được nghiên cứu. Ngoài ra, nguồn phải tương thích với độ nhạy của máy dò dùng để chụp ảnh, cho dù đó là mắt người, máy nhân quang, ống video tăng cường hay hệ thống camera kỹ thuật số. Sự lựa chọn cũng phụ thuộc vào chế độ chiếu sáng. Các yêu cầu về kính hiển vi huỳnh quang trường rộng được đáp ứng với các nguồn phóng điện hồ quang hoặc điốt phát sáng (LED , trong khi kính hiển vi đồng tiêu, phản xạ nội toàn phần và đa photon yêu cầu sự thích ứng của các hệ thống laser khác nhau. Khi chọn nguồn sáng cho huỳnh quang, điều quan trọng cần nhớ là hầu hết các fluorophores đều bị kích thích bởi các bước sóng cực tím, xanh lam và xanh lục. Ánh sáng phát ra từ các nguồn phổ biến nhất, đèn phóng điện hồ quang (Hình 5(a) đến 5(c)), sáng hơn từ 10 đến 100 lần so với đèn halogen thạch anh 12 volt thường được sử dụng để chiếu sáng bằng ánh sáng truyền qua. Nguồn chiếu sáng ưa thích cho kính hiển vi huỳnh quang trường rộng là đèn hồ quang thủy ngân (Hình 5(a)), thường được đưa vào cấu hình kính hiển vi mô hình cơ bản. Đèn hồ quang xenon (Hình 5(b)) có thể được sử dụng khi phân tích định lượng là quan trọng, và nguồn sáng halogen kim loại (Hình 5(c)) kết hợp với kính hiển vi thông qua chất dẫn ánh sáng lỏng đã trở nên rất phổ biến. Bất kỳ thiết kế nào trong số ba thiết kế đèn hồ quang chính đều phù hợp cho hơn 90% nghiên cứu về huỳnh quang. Các nguồn chiếu sáng LED (Hình 5(d)) cũng đang nổi lên như một giải pháp thay thế khả thi và ổn định cho đèn hồ quang. Được trình bày trong Hình 5 là cấu hình đầu ra quang phổ của các nguồn sáng huỳnh quang được sử dụng rộng rãi nhất.
Sự đa dạng rộng rãi của các ứng dụng kính hiển vi huỳnh quang thường đòi hỏi nhiều nguồn sáng và bước sóng khác nhau để đáp ứng nhu cầu của các chất huỳnh quang và điều kiện hình ảnh cụ thể. Trong một số trường hợp, có thể cần phải chiếu xạ rất thấp kết hợp với hệ thống camera siêu nhạy, trong khi đối với các nghiên cứu khác, có thể cần phải kích thích bằng tia laser mạnh để tiêu diệt tế bào sống hoặc tẩy trắng có chọn lọc chất fluorophore. Các yêu cầu về bước sóng thường trải rộng trên toàn bộ vùng khả kiến của quang phổ cũng như các phần của tia cực tím và hồng ngoại. Bởi vì những yêu cầu chiếu sáng đa dạng này không thể được đáp ứng bằng một nguồn sáng duy nhất, nên các nhà sản xuất hiện cung cấp các bộ chuyển đổi cho phép gắn đồng thời hai hoặc nhiều đèn vào một kính hiển vi.
Cấu hình kính hiển vi huỳnh quang
Trung tâm của kính hiển vi huỳnh quang hiện đại là bộ chiếu sáng thẳng đứng ánh sáng phản xạ, được kẹp giữa các ống quan sát và ống mang vật kính, như minh họa trong Hình 6. Bộ chiếu sáng được thiết kế để định hướng ánh sáng được tạo ra bởi nguồn cường độ cao (chẳng hạn như đèn phóng điện hồ quang) lên mẫu vật bằng cách trước tiên tập trung ánh sáng qua vật kính hiển vi trên mặt phẳng tiêu cự bên của mẫu vật và sau đó sử dụng cùng vật kính đó để thu ánh sáng phát ra từ mẫu vật. Loại chiến lược chiếu sáng này có một số lợi thế. Vật kính của kính hiển vi, hoạt động đầu tiên bằng cách đóng vai trò như một tụ quang được hiệu chỉnh tốt, tiếp theo thu thập phát xạ huỳnh quang tạo thành hình ảnh để truyền đến thị kính hoặc hệ thống phát hiện camera. Như vậy, vật kính luôn được căn chỉnh chính xác. Hơn nữa, hầu hết ánh sáng kích thích bị phân tán hoặc phản xạ bởi mẫu vật (trên góc 360 độ) sẽ truyền ra khỏi thành phần thấu kính vật kính phía trước, thay vì chiếu trực tiếp vào kính, như trường hợp chiếu sáng huỳnh quang truyền qua. Cuối cùng, khu vực mẫu vật được chiếu sáng được giới hạn ở cùng khu vực đang được quan sát và cả sự chiếu sáng và thu thập ánh sáng đều có thể sử dụng toàn bộ khẩu độ số của vật kính.
Bộ phận quan trọng trong kính hiển vi huỳnh quang
Bằng cách tuân theo một số biện pháp phòng ngừa hạn chế, người mới sử dụng kính hiển vi có thể đảm bảo rằng hầu hết các nghiên cứu bằng kính hiển vi huỳnh quang đều có thể mang lại kết quả thành công. Có lẽ khía cạnh quan trọng nhất trong huỳnh quang là đảm bảo rằng các bộ lọc truyền các bước sóng cần thiết để kích thích và phát xạ, đồng thời chặn ánh sáng ngoài dải một cách hoàn toàn nhất có thể. Trong thực tế, điều này thường khá khó khăn vì ánh sáng kích thích thường sáng hơn ánh sáng phát xạ ít nhất một triệu lần. Để xem xét, tất cả ánh sáng kích thích phải được chặn không cho tiếp cận thị kính và máy dò camera, trong khi càng nhiều ánh sáng phát xạ càng tốt phải được thu lại và hướng đến các cảm biến hình ảnh.
Nguồn sáng trong kính hiển vi huỳnh quang phải được lựa chọn cẩn thận để cung cấp lượng năng lượng kích thích lớn trong phạm vi yêu cầu của quang phổ (thường là 10 đến 100 nanomet trên mỗi băng thông). Trong nhiều trường hợp, đèn phóng điện hồ quang phát vạch có thể được sử dụng thành công, đặc biệt khi mẫu được dán nhãn huỳnh quang có các đỉnh hấp thụ tương ứng với các vạch quang phổ của nguồn sáng. Ví dụ: Alexa Fluors 405 và 546 là các chất huỳnh quang tổng hợp chồng lên các vạch 405 và 546 nanomet được tạo ra bởi đèn hồ quang thủy ngân. Sử dụng các thuốc nhuộm này với đèn thủy ngân sẽ đảm bảo phát xạ rất sáng, tương đối dễ hình dung và ghi lại. Một số chất huỳnh quang được điều chỉnh để phù hợp với dòng phóng điện hồ quang và tia laser cụ thể hiện được cung cấp bởi các nhà sản xuất thuốc nhuộm hậu mãi. Khi cần chọn chất huỳnh quang được kích thích ở vùng liên tục công suất thấp của đèn thủy ngân hoặc đèn xenon (chẳng hạn như Alexa Fluor 488 hoặc protein huỳnh quang màu lục tăng cường), người sử dụng kính hiển vi nên xem xét chuyển sang đèn LED hoặc đèn halogen kim loại, có tính năng sản lượng điện cao hơn ở những khu vực này.
Một trong những điểm quan trọng nhất cần xem xét khi tiến hành nghiên cứu bằng kính hiển vi huỳnh quang là mức phát xạ huỳnh quang rất thấp do mẫu vật tạo ra, như đã thảo luận nhiều lần ở trên. Vật kính có nhiệm vụ thu thập càng nhiều lượng khí thải này càng tốt để thu được kết quả tốt nhất với vật kính có khẩu độ số lớn nhất. Để xem xét, lượng ánh sáng phát xạ tới máy dò sẽ thấp với các vật kính có khẩu độ số nhỏ hơn 0,5, trong khi đó nếu khẩu độ vật kính có kích thước gấp đôi thì có thể thu được khoảng 16 lần phát xạ huỳnh quang. Vật liệu nhúng, đặc biệt là dầu, giúp loại bỏ hiện tượng mất ánh sáng do sự phản chiếu ánh sáng từ bề mặt kính, do đó tạo ra hình ảnh thậm chí còn sáng hơn. Sự so sánh các hình nón ánh sáng có khẩu độ số vật kính của kính hiển vi được trình bày trong Hình 8 để chứng minh sự khác biệt lớn về lượng ánh sáng thu được.
Khi kết hợp với kính hiển vi huỳnh quang, hệ thống quang học cho phép các nhà nghiên cứu nghiên cứu nhiều hiện tượng trong sinh học tế bào. Trước hết là phân tích sự phân bố nội bào của các đại phân tử cụ thể trong các tổ hợp dưới tế bào, chẳng hạn như nhân, màng, sợi tế bào, ty thể, bộ máy Golgi và mạng lưới nội chất. Ngoài các quan sát trạng thái ổn định của giải phẫu tế bào, hệ thống quang học còn hữu ích để thăm dò động lực nội bào và sự tương tác giữa các đại phân tử khác nhau (bao gồm khuếch tán, hằng số liên kết, tốc độ phản ứng enzyme và nhiều cơ chế phản ứng khác nhau) trong các phép đo được giải quyết theo thời gian. Tương tự như vậy, các chức năng quan trọng của tế bào như nhập bào, xuất bào, truyền tín hiệu và tạo điện thế xuyên màng đã được kiểm tra bằng kính hiển vi huỳnh quang. Do cấu hình phát xạ cực kỳ nhạy, độ phân giải không gian và độ đặc hiệu cao của nghiên cứu huỳnh quang, kỹ thuật này nhanh chóng trở thành một công cụ quan trọng trong di truyền và sinh học tế bào, đồng thời dẫn đầu trong nghiên cứu y sinh.
Nguồn: https://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/fluorescence.html
Công ty Minh Khang là nhà phân phối độc quyền thị trường miền Nam phân khúc kính hiển vi hãng Carl ZEISS.
EN