Giới thiệu
Khẩu độ số của ống kính là thước đo khả năng thu nhận ánh sáng và độ phân giải chi tiết mẫu vật. Sóng ánh sáng tạo ảnh truyền qua mẫu vật và đi vào vật kính theo hình nón ngược như minh họa trên Hình 1(a). Ánh sáng trắng bao gồm một phổ rộng các sóng điện từ, độ dài chu kỳ của nó nằm trong khoảng từ 400 đến 700 nanomet. Để tham khảo, điều quan trọng cần biết là 1 milimet bằng 1000 micromet và 1 micromet bằng 1000 nanomet. Ánh sáng màu xanh có dải bước sóng tập trung ở 550 nanomet, tương ứng với 0,55 micromet. Nếu nhìn những vật nhỏ (chẳng hạn như một mẫu vật được nhuộm màu điển hình gắn trên lam kính) qua kính hiển vi, thì ánh sáng tới trên những vật nhỏ này sẽ bị nhiễu xạ khiến nó lệch khỏi hướng ban đầu (Hình 1(a)). Vật càng nhỏ thì sự nhiễu xạ của tia sáng tới càng rõ rệt. Giá trị khẩu độ số cao hơn cho phép các tia ngày càng xiên đi vào thấu kính vật kính phía trước, tạo ra hình ảnh có độ phân giải cao hơn và cho phép hiển thị các cấu trúc nhỏ hơn với độ rõ nét cao hơn. Minh họa trong Hình 1(a) là một hệ thống kính hiển vi đơn giản bao gồm vật kính và mẫu vật được chiếu sáng bằng chùm ánh sáng chuẩn trực, trường hợp này sẽ xảy ra nếu không sử dụng tụ quang. Ánh sáng nhiễu xạ bởi mẫu vật được biểu diễn dưới dạng hình nón ngược có nửa góc (α), biểu thị giới hạn ánh sáng có thể đi vào vật kính. Để tăng khẩu độ hiệu quả và khả năng phân giải của kính hiển vi, một tụ quang (Hình 1(b)) được thêm vào để tạo ra hình nón tia ở phía chiếu sáng của mẫu vật. Điều này cho phép vật kính thu thập các tia sáng là kết quả của góc nhiễu xạ lớn hơn, làm tăng độ phân giải của hệ thống kính hiển vi. Tổng các góc khẩu độ của vật kính và tụ quang được gọi là độ mở khả dụng. Nếu góc khẩu độ của tụ quang phù hợp với vật kính thì sẽ thu được độ phân giải tối đa.
Để cho phép so sánh hai vật kính và đạt được khả năng xử lý định lượng về độ phân giải, khẩu độ số hoặc thước đo góc khối được bao phủ bởi vật kính được xác định là:
Khẩu độ số (NA) = η • sin(α) (1)
trong đó α bằng một nửa góc mở của vật kính và η là chiết suất của môi trường ngâm được sử dụng giữa vật kính và màng chắn bảo vệ mẫu vật (η = 1 đối với không khí; η = 1,51 đối với dầu hoặc thủy tinh). Bằng cách kiểm tra phương trình (1), rõ ràng chiết suất là hệ số giới hạn trong việc đạt được khẩu độ lớn hơn 1,0. Do đó, để có được khẩu độ số làm việc cao hơn, chiết suất của môi trường giữa thấu kính phía trước của vật kính và màng chắn phải được tăng lên. Khẩu độ góc cao nhất có thể đạt được với vật kính tiêu chuẩn về mặt lý thuyết sẽ là 180 độ, dẫn đến giá trị 90 độ cho nửa góc được sử dụng trong phương trình khẩu độ số. sin(90°) = 1, điều này cho thấy khẩu độ số bị giới hạn không chỉ bởi khẩu độ góc mà còn bởi chiết suất của môi trường hình ảnh. Trên thực tế, góc khẩu độ vượt quá 70 đến 80 độ chỉ được tìm thấy ở những vật kính có hiệu suất cao nhất thường có chi phí rất cao.
Độ phân giải của kính hiển vi quang học được định nghĩa là khoảng cách nhỏ nhất giữa hai điểm trên mẫu vật mà vẫn có thể phân biệt được thành hai thực thể riêng biệt. Độ phân giải liên quan trực tiếp đến độ phóng đại hữu ích của kính hiển vi và giới hạn cảm nhận của chi tiết mẫu vật, mặc dù nó là một giá trị chủ quan trong kính hiển vi vì ở độ phóng đại cao, hình ảnh có thể bị mất nét nhưng vẫn được phân giải ở khả năng tối đa của vật kính và các thành phần quang học hỗ trợ. Do tính chất sóng của ánh sáng và sự nhiễu xạ liên quan đến những hiện tượng này, độ phân giải của vật kính được xác định bởi góc của sóng ánh sáng có thể đi vào thấu kính phía trước và do đó thiết bị được cho là bị giới hạn nhiễu xạ. Giới hạn này hoàn toàn là lý thuyết, nhưng ngay cả một mục tiêu lý tưởng về mặt lý thuyết mà không có bất kỳ lỗi hình ảnh nào cũng có độ phân giải hữu hạn.
Người quan sát sẽ bỏ lỡ các sắc thái tinh tế trong hình ảnh nếu vật kính chiếu chi tiết lên mặt phẳng hình ảnh trung gian nhỏ hơn khả năng phân giải của mắt người (tình huống điển hình ở độ phóng đại thấp và khẩu độ số cao). Hiện tượng phóng đại trống sẽ xảy ra nếu hình ảnh được phóng to vượt quá khả năng phân giải vật lý của hình ảnh. Vì những lý do này, độ phóng đại hữu ích đối với người quan sát phải tối ưu trên 500 lần khẩu độ số của vật kính, nhưng không cao hơn 1.000 lần khẩu độ số
Dung dịch ngâm
Một cách để tăng khả năng phân giải quang học của kính hiển vi là sử dụng chất lỏng ngâm giữa thấu kính trước của vật kính và màng chắn. Hầu hết các vật kính có độ phóng đại từ 60x đến 100x (và cao hơn) được thiết kế để sử dụng với dầu ngâm. Người ta đã thu được những kết quả tốt với loại dầu có chiết suất n = 1,51, khớp chính xác với chiết suất của thủy tinh. Nếu không sử dụng phương pháp này, sự phản chiếu sẽ luôn gây mất ánh sáng ở nắp đậy hoặc trên thấu kính trước trong trường hợp góc lớn (Hình 2).
Bảng 1: Khẩu độ số khách quan so với hiệu chỉnh quang học
| Độ phóng đại | Plan Achromat (NA) |
Plan Fluorite (NA) |
Plan Apochromat (NA) |
| 0,5 lần | 0.025 | n/a | n/a |
| 1x | 0.04 | n/a | n/a |
| 2x | 0.06 | 0.08 | 0.10 |
| 4x | 0.10 | 0.13 | 0.20 |
| 10 lần | 0.25 | 0.30 | 0.45 |
| 20x | 0.40 | 0.50 | 0.75 |
| 40 lần | 0.65 | 0.75 | 0.95 |
| 40x (dầu) | n/a | 1.30 | 1.40 |
| 63x | 0.75 | 0.85 | 0.95 |
| 63x (dầu) | n/a | 1.30 | 1.40 |
| 100x (dầu) | 1.25 | 1.30 | 1.40 |
Độ phân giải của Airy Disk và kính hiển vi
Khi ánh sáng từ các điểm khác nhau của mẫu vật đi qua vật kính và được tái tạo thành ảnh, các điểm khác nhau của mẫu vật sẽ xuất hiện trong ảnh dưới dạng các mẫu nhỏ (không phải điểm) được gọi là Airy Disk. Hiện tượng này là do nhiễu xạ hoặc tán xạ ánh sáng khi nó đi qua các phần và khoảng trống nhỏ trong mẫu vật và khẩu độ hình tròn phía sau của vật kính. Giới hạn mà hai vật thể nhỏ vẫn được coi là những thực thể riêng biệt được sử dụng làm thước đo khả năng phân giải của kính hiển vi. Khoảng cách mà giới hạn này đạt đến được gọi là độ phân giải hiệu dụng của kính hiển vi và được ký hiệu là d0. Độ phân giải là một giá trị có thể được suy ra về mặt lý thuyết dựa trên các thông số quang học của thiết bị và bước sóng chiếu sáng trung bình.
Trước hết, điều quan trọng là phải biết rằng vật kính và thấu kính ống không tạo ảnh một điểm trong vật như một đĩa sáng với các cạnh được xác định rõ ràng, mà là một vùng hơi mờ các điểm được bao quanh bởi các vòng nhiễu xạ, gọi là Airy Disk (xem Hình 3(a)). Biểu diễn ba chiều của mẫu nhiễu xạ gần mặt phẳng ảnh trung gian được gọi là hàm trải rộng điểm (Hình 3(b)). Airy Disk là vùng được bao quanh bởi mức tối thiểu đầu tiên của mẫu khí và chứa khoảng 84% năng lượng phát sáng, như được mô tả trong Hình 3(c). Hàm trải rộng điểm là biểu diễn ba chiều của Airy Disk.
Độ phân giảix,y = λ / 2[η • sin(α)] (2) Độ phân giảiz = 2λ / [η • sin(α)] 2 (3)
trong đó λ là bước sóng ánh sáng, η đại diện cho chiết suất của môi trường tạo ảnh như mô tả ở trên, và η • sin(α) được gọi là khẩu độ số vật kính (NA). Các vật kính thường được sử dụng trong kính hiển vi có khẩu độ số nhỏ hơn 1.5, hạn chế số hạng α trong các phương trình (2) và (3) ở mức nhỏ hơn 70 độ (mặc dù các vật kính hiệu suất cao mới tiến gần đến giới hạn này). Do đó, giới hạn độ phân giải lý thuyết ở bước sóng thực tế ngắn nhất (khoảng 400 nanomet) là khoảng 150 nanomet ở chiều bên và đạt gần 400 nanomet ở chiều trục khi sử dụng vật kính có khẩu độ số 1,40. Do đó, các cấu trúc nằm gần hơn khoảng cách này không thể được phân giải trong mặt phẳng bên bằng kính hiển vi. Do tầm quan trọng chủ yếu của mối quan hệ qua lại giữa chiết suất của môi trường tạo ảnh và khẩu độ góc của vật kính, Abbe đã đưa ra khái niệm khẩu độ số trong quá trình giải thích độ phân giải của kính hiển vi.
Các vòng nhiễu xạ trong Airy disk được gây ra bởi chức năng giới hạn của khẩu độ vật kính sao cho vật kính đóng vai trò như một lỗ trống, phía sau có các vòng nhiễu xạ. Khẩu độ của vật kính và tụ quang càng cao thì d0 sẽ càng nhỏ. Do đó, khẩu độ số của toàn bộ hệ thống càng cao thì độ phân giải càng tốt. Một trong nhiều phương trình liên quan đến công thức Abbe ban đầu được rút ra để thể hiện mối quan hệ giữa khẩu độ số, bước sóng và độ phân giải là:
Độ phân giảix,y hoặc d0 = 1.22λ / [NAObj + NACon ] (4)
Trong đó λ là bước sóng hình ảnh của ánh sáng, NACon là khẩu độ số của tụ điện và NAObj bằng khẩu độ số ống kính. Hệ số 1.22 được lấy từ tính toán cho trường hợp được minh họa trong Hình 4 đối với sự tiếp cận gần của hai Airy disk trong đó các đường cong cường độ được xếp chồng lên nhau. Nếu hai điểm ảnh ở xa nhau thì dễ dàng nhận ra chúng là những vật thể riêng biệt. Tuy nhiên, khi khoảng cách giữa các đĩa Airy ngày càng giảm, điểm giới hạn sẽ đạt đến khi mức tối đa chính của Airy disk thứ hai trùng với mức tối thiểu đầu tiên của Airy disk thứ nhất. Các cấu hình xếp chồng hiển thị hai cực đại độ sáng cách nhau bởi khoảng. Cường độ trong khoảng này giảm khoảng 20 phần trăm so với hai cực đại. Điều này vừa đủ để mắt người nhìn thấy hai điểm riêng biệt, một giới hạn được gọi là tiêu chuẩn Rayleigh .
Bảng 2: Độ phân giải của các vật kính đã chọn
| Objective/NA | d0 (μm) |
D0 (μm) |
n |
| 0.5x / 0.15 | 2.2 | 11.2 | 1786 |
| 10x / 0.30 | 1.1 | 11.2 | 1786 |
| 20x / 0.50 | 0.7 | 13.4 | 1493 |
| 40x / 0.75 | 0.45 | 17.9 | 1117 |
| 40x / 1.30 (oil) | 0.26 | 10.3 | 1942 |
| 63x / 1.40 (oil) | 0.24 | 15.1 | 1325 |
| 100x / 1.30 (oil) | 0.26 | 25.8 | 775 |
Không cần phải tăng độ phóng đại tổng thể của kính hiển vi bằng cách sử dụng thị kính có độ phóng đại bổ sung cao (ví dụ: 16x, 20x hoặc 25x). Mặt khác, bạn sẽ bỏ lỡ các sắc thái tinh tế nếu vật kính chiếu các chi tiết rất đẹp lên hình ảnh trung gian và bạn đang sử dụng thị kính có độ phóng đại thấp. Để quan sát chi tiết mẫu vật tốt trong kính hiển vi quang học, các đặc điểm nhỏ có trong mẫu vật phải có đủ độ tương phản và chiếu hình ảnh trung gian ở góc lớn hơn một chút so với khả năng phân giải góc của mắt người. Như đã đề cập trước đó, độ phóng đại tổng thể (vật kính và thị kính) của kính hiển vi phải cao hơn 500x, nhưng nhỏ hơn 1000x khẩu độ vật kính.
Trong các quan sát hàng ngày, nhiều nhà kính hiển vi không cố gắng đạt được độ phân giải hình ảnh cao nhất có thể với thiết bị của họ. Khả năng phân giải của kính hiển vi là tính năng quan trọng nhất của hệ thống quang học và ảnh hưởng đến khả năng phân biệt các chi tiết nhỏ của một mẫu vật cụ thể. Yếu tố chính trong việc xác định độ phân giải là khẩu độ số khách quan, nhưng độ phân giải cũng phụ thuộc vào loại mẫu vật, sự kết hợp của ánh sáng, mức độ hiệu chỉnh quang sai và các yếu tố khác như phương pháp tăng cường độ tương phản trong hệ thống quang học của kính hiển vi hoặc trong chính mẫu vật đó.
Những gợi ý để tăng độ phân giải
Vật kính của kính hiển vi hiện đại cho phép khả năng phân giải lý thuyết được hiện thực hóa trong thực tế với điều kiện là quan sát được các mẫu vật phù hợp. Tuy nhiên, có một số gợi ý có thể được làm theo để đảm bảo độ phân giải tối ưu bao gồm:
- Vật kính và mẫu vật có sạch không? Dấu vân tay trên thấu kính trước của vật kính có thể làm ảnh hưởng đến việc tái tạo hình ảnh có độ tương phản cao của mẫu vật do ánh sáng tán xạ không mong muốn. Những lưu ý tương tự cũng áp dụng cho các vật kính ngâm bị dính cặn nhựa hoặc nhũ tương (chẳng hạn như dầu và nước). Trong những trường hợp này, việc vệ sinh cẩn thận thành phần thấu kính trước bằng vải mềm và chất tẩy rửa thấu kính hoặc etanol nguyên chất sẽ giảm bớt tình trạng.
- Các màng chắn có độ dày chính xác không? Điều cực kỳ quan trọng là các màng chắn phải phù hợp với vật kính có khẩu độ lớn (lớn hơn 0,65) có độ dày tiêu chuẩn là 170 micromet. Do đó, nếu sử dụng màng chắn có độ dày khác (nhỏ hơn 165 hoặc lớn hơn 175 micromet), chất lượng của hình ảnh quang học sẽ bị ảnh hưởng rõ rệt. Nói chung, nguyên tắc nhỏ đối với các vật kính có khẩu độ số từ 0,7 trở lên là chúng có thể chịu được sai số 10 micromet, trong khi các vật kính có khẩu độ số nhỏ hơn (0,3 đến 0,7) có thể chịu được mức độ lệch cao hơn, thường lên tới 30 micromet.
- Bạn có đang sử dụng đúng loại dầu ngâm không? Tất cả các vật kính có khẩu độ lớn hơn 0,95 được thiết kế để sử dụng với dung dịch ngâm (thường là dầu có chiết suất 1.515). Dầu ngâm không chứa biphenyl polyclo hóa và hầu như không có khả năng tự phát huỳnh quang. Hình ảnh sẽ bị suy giảm rõ rệt nếu có bọt khí trên lớp ngâm, vì vậy phải bôi dầu cẩn thận để tránh bọt khí. Có thể dễ dàng nhìn thấy bọt khí bằng cách tháo thị kính và kiểm tra mặt phẳng tiêu cự phía sau của vật kính thông qua các ống quan sát của kính hiển vi (hoặc sử dụng thấu kính Bertrand). Nếu quan sát thấy bọt khí, vật kính và tiêu bản phải được làm sạch và bôi lại dầu cẩn thận.
Nguồn: https://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/resolution.html
Công ty Minh Khang là nhà phân phối độc quyền thị trường miền Nam phân khúc kính hiển vi hãng Carl ZEISS.
EN