Khắc phục sự cố khi thực hành quy trình mô học thường quy

Bối cảnh của việc khắc phục sự cố xử lý mô học

• Do quy trình làm việc của mô học rất phức tạp và liên quan đến nhiều vật tư tiêu hao khác nhau nên việc khắc phục sự cố thường rất khó khăn.
• Vật tư tiêu hao dành riêng cho các bước cụ thể có thể khác nhau về thành phần hóa học, tính chất vật lý và thậm chí khác nhau về kích thước và màu sắc.
• Việc bổ sung nhiều loại thiết bị trên thị trường với – khả năng khác nhau, tính dễ vận hành và giao diện khách hàng – khiến việc khắc phục sự cố thậm chí còn khó khăn hơn.
• Người vận hành được đào tạo tốt sẽ giảm thiểu công việc lặp lại, giảm thời gian và chi phí xét nghiệm, cải thiện hiệu suất chăm sóc bệnh nhân.

Quy trình mô học

Phẫu tích

• Khi xử lý mô tươi, hãy xử lý nhẹ nhàng để tránh tổn thương mô
• Không bao giờ để mẫu bị khô; làm ẩm bằng nước muối nếu cần.
• Mẫu vật cần cắt phải phù hợp với cassette
• Các mẫu vật lớn cần cắt rãnh để cho phép chất cố định ngấm tối ưu vào các vùng dày hơn của mẫu vật.
• Sử dụng hộp chứa có kích thước phù hợp với lượng chất cố định vừa đủ cho mô (tỷ lệ ít nhất là 20:1)

Cố định mô

• Sử dụng chất cố định chính xác hoặc chất cố định được thiết kế cho loại mô.
• Sử dụng chất cố định có chất lượng cao và ở độ pH đã biết. Nếu sử dụng formalin ở pH axit, nó sẽ nhanh chóng tạo ra “sắc tố formalin” (hematin axit formaldehyde) bằng phản ứng với huyết sắc tố.
• Khi sử dụng chất cố định không đông tụ hoặc liên kết ngang cho các mẫu sẽ tuân theo quy trình IHC, hãy theo dõi cẩn thận thời gian cố định và ghi nhớ về việc thêm bước thu hồi kháng nguyên.
• Lưu ý tỷ lệ cố định và mô thích hợp (lý tưởng nhất là 20:1).
• Thời gian cố định mô là rất quan trọng và cụ thể đối với kích thước và loại mô

Khử canxi

• Kích thước xương quyết định chất khử canxi phải được sử dụng (axit mạnh và axit yếu).
• Quá trình khử canxi quá lâu sẽ dẫn đến mất hình thái.
• Thời gian không phù hợp sẽ gây khó khăn cho việc phân chia
• Các mẫu để xét nghiệm IHC hoặc ISH có thể yêu cầu chất khử canxi đặc biệt (EDTA).
• Một số mô không bị vôi hóa có thể cần phải khử canxi khi muối canxi xuất hiện bất ngờ (ví dụ: sỏi thận, mạch máu bị vôi hóa).

Xử lý mô

• Sử dụng thời gian xử lý chính xác tùy theo kích thước và loại mô; dưới các mẫu đã được xử lý khiến việc phân chia không thể thực hiện được, các mô được xử lý quá mức sẽ mất tính toàn vẹn về hình thái khiến chúng không đủ để chẩn đoán chính xác.
• Sử dụng thuốc thử tối ưu
  – thuốc thử cồn, lý tưởng nhất là ở nồng độ tăng dần.
  – khi sử dụng chất thay thế xylene, hãy tăng thời gian xử lý và luân chuyển thường xuyên hơn.
  – parafin, loại ngấm lý tưởng với lượng chất hóa dẻo hạn chế.
• Nếu có thể, sử dụng máy khuấy trên máy xử lý mô. Sử dụng chân không để hỗ trợ quá trình thấm thuốc thử.
• Lựa chọn cassette phù hợp:
  – kích thước lỗ rỗng tùy thuộc vào kích thước mẫu vật.
  – được xác nhận để sử dụng trên máy in tự động.

Vùi mô

• Sử dụng kỹ thuật vùi mô phù hợp:
  – hướng mẫu thích hợp (ví dụ: mẫu dài, mẫu cứng hoặc dạng sợi).
  – khuôn tối ưu (kích thước, loại).
  – tránh tạo bọt khí khi tạo khối.
• Theo dõi nhiệt độ của kẹp, tấm nóng (hư nhiệt) và tấm lạnh (nứt paraffin) để tránh tạo tác.
• Không đổ đầy hoặc thiếu paraffin vào khuôn.
• Chọn phương tiện vùi mô tốt nhất:
  – parafin có hàm lượng polymer cao giúp hỗ trợ cấu trúc tốt hơn.
  – chứa thuốc nhuộm để quan sát tốt hơn các mẫu nhỏ hoặc mờ đục.

Cắt paraffin

• Luôn chọn dao cắt chất lượng cao:
  – cân nhắc sử dụng cấu hình cao cho các mẫu dày đặc, cứng.
  – lưỡi cắt thấp dành cho mẫu vật mềm và có kích thước sinh thiết.
• Góc cắt được tối ưu hóa (góc nghiêng) cho từng loại microtome và dao cắt, cắt tỉa khối cẩn thận (với khoảng tăng 20μ).
• Để tránh bị nén, hãy làm lạnh các khối đã được cắt tỉa cẩn thận trên bề mặt ẩm ướt và lạnh.
• Theo dõi nhiệt độ bể điều nhiệt để tránh giãn nở và tách quá mức.
• Siết chặt tất cả các kẹp (kẹp lưỡi dao, đế giá đỡ dao, độ nghiêng dao, định hướng mâm cặp, góc hở) để tránh tạo ra chuyển động
• Các lam kính (được phủ) được khuyến khích sử dụng khi cắt các mô khó khăn hoặc cắt các quy trình IHC/ISH/Nhuộm đặc biệt để ngăn chặn các phần bị bong ra hoặc nâng lên.
• Không sử dụng keo dán lam trên các lam kính đã có lớp phủ bề mặt.

Cắt lạnh

• Chọn lưỡi cắt phù hợp với loại mô:
  – thử cấu hình cao cho các mẫu dày đặc, cứng.
• Vì đang cắt các mẫu không cố định, thường dày hơn các phần parafin, nên sử dụng các lam kính (có lớp phủ) để ngăn ngừa phần tách ra hoặc nâng lên.
• Tạo khối đông lạnh không có bọt khí bằng cách sử dụng kỹ thuật phù hợp và hợp chất cắt đông lạnh chất lượng tốt nhất.

Nhuộm thường quy

• Trước khi nhuộm, để ráo các lam kính theo chiều dọc, sau đó sấy khô ở khoảng. 60-70˚C. Nhiệt độ cao hơn có thể khiến các phần bị nứt.
• Tối ưu hóa tất cả các bước nhuộm, thời gian chính xác và tốc độ khuấy trộn. Sử dụng các slide kiểm soát thường xuyên để theo dõi chất lượng vết nhuộm. Không thay đổi thời gian đóng hệ thống nhuộm đã được xác nhận trừ khi được phép.
• Hematoxylin đốm, nhuộm eosin nhạt là dấu hiệu của thuốc nhuộm bị hư hỏng.
• Màu không đều hoặc không đều là dấu hiệu của việc quản lý kém việc luân chuyển/thay thế thuốc thử phụ.
• Chọn chất phân biệt thích hợp cho kiểu nhuộm: hóa chất làm mềm – axit yếu, hoá chất tạo màu – axit mạnh.
• Khi sử dụng chất thay thế xylene, hãy tăng thời gian nhuộm và xoay/thay thế thường xuyên hơn.

Dán lam

• Khi sử dụng tiêu bản tự động, luôn sử dụng keo dám lam cao cấp để tránh tình trạng hai lam kính dính vào nhau hoặc bị kẹt dụng cụ
• Khi thay đổi vật liệu lắp đặt (loại, nhãn hiệu) luôn điều chỉnh cài đặt thiết bị để có độ nhớt thích hợp; việc thay kim cũng có thể cần thiết.
• Khi đổ vật liệu mới vào môi trường ngâm, hãy để nó thông thoáng để tránh bong bóng hoặc bọt khí dưới phiến kính. Trước mỗi lần sử dụng, hãy làm theo các bước mồi thiết bị để loại bỏ không khí bên trong
• Sử dụng phiến kính có kích thước phù hợp để tránh tạo ta các bọt khí
• Lý tưởng nhất là dung môi trong bể dán lam phải giống với dung môi trên máy nhuộm để có khả năng tương thích tối đa.
• Sử dụng keo dán lam có chứa chất chống oxy hóa để tránh làm phai màu các lam kính bị ố.

Lưu trữ và bảo quản

• Tùy thuộc vào loại phương tiện lắp đặt, hầu hết đều sẵn sàng để xử lý và xem trong vòng vài phút.
• Tuy nhiên, sau khi các tiêu bản được phủ lên, chúng vẫn cần thêm thời gian để được lưu trữ.
• Keo dán lam sẽ đông cứng hoàn toàn sau 48-72 giờ và chỉ khi đó các tiêu bản mới có thể được xếp chồng lên nhau để lưu trữ hoặc vận chuyển. Nếu không đủ thời gian, vật liệu lắp bị rò rỉ từ bên dưới các lam kính sẽ khiến chúng dính vào nhau
• Quy trình đặt mẫu trên lam kính quá sớm sẽ gây ra tình trạng keo dán bị dính dưới bề mặt lam kính
• Mặc dù keo dán lam chất lượng tốt có chứa chất chống phai màu nhưng tốt hơn là để chúng tránh ánh nắng trực tiếp
• Chất lượng bảo quản lâu dài của keo dán lam phải được biết rõ vì tinh thể có thể xuất hiện trong keo dán kém, đôi khi sau một thời gian dài (tháng hoặc năm).

Tóm tắt

Hiểu rõ tất cả các bước mô học, khoa học và lựa chọn sản phẩm tiêu hao sẽ:

• Giảm thiểu công việc lặp đi lặp lại
• Giảm thời gian và chi phí phòng thí nghiệm
• Tối ưu hóa quy trình làm việc
• Cải thiện hiệu quả chăm sóc bệnh nhân

Nguồn: https://www.leicabiosystems.com/knowledge-pathway/troubleshooting-routine-histology-a-guide-on-how-to-avoid-common-mistakes/