Các nhà nghiên cứu khoa học thần kinh cần phải quan sát các lát cắt của toàn bộ não để xác định vị trí các chi tiết của não được soi dưới dưới kính hiển vi. Não cần được làm cứng để cho phép cắt thành các lát mỏng hoặc sử dụng máy cắt tiêu bản rung, nhưng tốc độ chậm hơn nhiều. Việc vùi mô với parafin thường được sử dụng cho các mẫu y tế và chỉ có tác dụng đối với mẫu nhỏ hoặc mỏng, parafin không thể thâm nhập vào trung tâm não bộ của động vật gắm nhấm. Vì thế, các nhà nghiên cứu khoa học thần kinh sẽ áp dụng phương pháp đông lạnh để làm cứng mô não trước khi tiến hành cắt lát.
Việc đông lạnh làm hư hỏng màng tế bào và làm giảm khả năng đọc mô của các mẫu sinh học. Dưới đây trình bày lý do tại sao, hậu quả và cách giảm thiểu hoặc tránh hư hỏng mẫu khi sử dụng phương pháp đông lạnh làm cứng mô.
Ba dạng rắn của nước
Nước tinh khiết có thể tồn tại ở trạng thái rắn dưới ba dạng khác nhau. Có hai dạng tinh thể là tinh thể lục giác và tinh thể lập phương. Nước cũng có thể đông lạnh nhanh đến mức không có thời gian để hình thành tinh thể, và vẫn giữ nguyên dạng vô định hình (dạng thủy tinh). Sự hình thành tinh thể là nguyên nhân gây ra sự giãn nở của nước khi đông lạnh (giãn nở khi đông lạnh là một tính chất chỉ có ở nước), vì vậy băng vô định hình không giãn nở khi đông đặc. Điều này làm cho nó trở thành hình thức đông lạnh tối ưu cho các mẫu sinh học.
Tốc độ đông lạnh tới hạn
Sự mở rộng hàm lượng nước bằng cách đông lạnh sẽ kéo dài và xuyên qua màng tế bào. Sự đông lạnh chậm thúc đẩy sự hình thành tinh thể băng và do đó giãn nở. Vật liệu sinh học là chất dẫn nhiệt kém. Do đó, có khả năng các gradient nhiệt sẽ tồn tại khi mẫu bị đông lạnh và một số tinh thể băng sẽ hình thành bên trong bất kỳ mảnh mô nào cách nguồn lạnh trên 10 mm. Được đặt trên một bề mặt lạnh để làm đông, các mẫu vật sẽ đông lạnh chậm và do đó có khả năng hình thành các tinh thể, đặc biệt là ở những phần xa nhất so với bề mặt lạnh. Khi cắt, mô đông lạnh chậm với sự hình thành tinh thể lớn sẽ có hiệu ứng “swiss cheese”, nhiều lỗ và lượng tế bào bị mất ở các mức độ khác nhau, tùy thuộc vào mức độ và kích thước của sự hình thành tinh thể.
Lưu ý rằng tốc độ đông lạnh chứ không phải nhiệt độ cuối mới là điều quan trọng lúc đầu. Sự đông lạnh nhanh phụ thuộc vào tỷ lệ phần trăm tổng bề mặt tiếp xúc với nguồn lạnh, thể tích nước, nhiệt độ ban đầu của nước (mẫu vật) và độ lạnh của nguồn. Lý tưởng nhất là nguồn lạnh có nhiệt độ cực lạnh và được bố trí tiếp xúc với mọi bề mặt.
Cắt lát mô càng sớm càng tốt
Tuy nhiên, ngay cả khi một mẫu vật được đông lạnh nhanh thành công ở dạng thủy tinh, nó có thể không giữ nguyên như vậy. Băng thủy tinh là một trạng thái không ổn định. Tại > -121˚C, băng vô định hình bắt đầu dần dần tái cấu trúc thành băng khối và nở ra. Tại > -80˚C, băng hình khối bắt đầu tái cấu trúc thành băng hình lục giác và giãn nở trở lại. Đây là quá trình chuyển đổi chậm, tùy thuộc vào độ dốc nhiệt độ và độ tinh khiết của nước.
Trong hầu hết các ứng dụng phổ biến, mô phải được gia nhiệt trên nhiệt độ đông lạnh nhanh để cắt (-9 đến -19˚C đối với não, nhưng tùy thuộc vào loại mô). Nếu không thì quá lạnh để cắt và sẽ vỡ khi bị dao vát uốn cong. Dấu hiệu dễ nhận thấy của việc cắt quá lạnh là “các vết nứt” hoặc vết vỡ song song với lưỡi dao. Việc cắt lát nên bắt đầu ngay khi mô đủ điều kiện để cắt. Không được giữ mô qua đêm hoặc trong thời gian dài trong máy cắt lạnh. Quá trình chuyển đổi từ băng thủy tinh sang tinh thể lục giác sẽ bắt đầu. Các tinh thể sẽ giản nỡ băng và làm hỏng các tế bào.
Nitơ lỏng
Để đông lạnh nhanh nhất, việc ngâm mô trong chất lỏng sẽ tạo ra sự tiếp xúc bề mặt nhiều nhất. Cách thứ hai là đặt trên giá đỡ kim loại đã được làm lạnh trước và nhanh chóng sử dụng carbon dioxide rắn được nghiền thành dạng bột để tối đa hóa diện tích bề mặt tiếp xúc, giúp làm lạnh mô nhanh chóng và đồng đều hơn
Nitơ lỏng là một trong những chất lỏng lạnh nhất hiện có. Nó không hòa tan với mô. Những đặc tính này dường như làm cho nó trở thành một môi trường đông lạnh lý tưởng. Tuy nhiên, nitơ lỏng có hằng số nhiệt dung riêng cực thấp. Khi mô tiếp xúc với nitơ lỏng, nhiệt từ mô sẽ làm cho chất làm lạnh sôi tại điểm tiếp xúc, gây ra hiện tượng sôi cục bộ. Một hậu quả khác là hình thành lớp hơi – khí nitơ, cách nhiệt và làm chậm đáng kể sự xâm nhập của hơi lạnh vào mô, do đó làm chậm tốc độ đông lạnh. Kết quả là, thường xảy ra trường hợp lớp mô bên ngoài nhanh chóng đông cứng ở dạng thủy tinh, nhưng sau đó lớp khí cách nhiệt được tạo ra, hơi lạnh xâm nhập chậm hơn và phần bên trong đông lạnh chậm hơn. Sự hình thành tinh thể làm giãn nở mô bên trong lớp đông lạnh và toàn bộ khối bị nứt. Một khối bị nứt cho thấy ít nhất mô trong cùng đã bị đông lạnh dạng tinh thể. Lưu ý rằng đây là vấn đề với các khối mô lớn, nhưng nitơ lỏng hoạt động rất tốt để đông lạnh sinh thiết hoặc các mẫu nhỏ hơn và được sử dụng thành công trong phòng thí nghiệm mô học lâm sàng.
Các giải pháp khác
Nhiều chất lỏng khác được sử dụng cho các khối lớn hơn với độ chính xác cao, đáng chú ý nhất là isopentane được làm lạnh đến -80˚C. Nó không tạo thành các lớp khí cách nhiệt và nếu mô có kích thước lớn hơn một centimet khối một chút, nó sẽ đông lạnh ở dạng tinh thể. Ngâm hoàn toàn trong chất lỏng là cần thiết để tiếp xúc bề mặt tối đa và không gây hư hỏng mô. Chuyển động qua chất lỏng là hữu ích.Một giải pháp khác là ngâm mô bằng dung dịch glycerine, polyethylene glycol (chất chống đông), glycerol hoặc sucrose. Những chất này sẽ phá vỡ sự hình thành tinh thể và làm giảm nhiệt độ đông lạnh. Sucrose ở mức 30% trong dung dịch đệm photphat thường được sử dụng, nhưng chỉ với mô được cố định tốt, sau khi cố định, vì áp suất thẩm thấu sẽ làm teo mô không cố định.
Nguồn: https://www.leicabiosystems.com/knowledge-pathway/freezing-biological-samples/
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các thiết bị Giải phẫu bệnh từ hãng Leica Biosystems.
EN