Acholeplasma laidlawii là một loại trực khuẩn gram âm thuộc lớp Mollicutes. Các loại nhuyễn thể bao gồm Mycoplasma và Acholeplasma . Động vật thân mềm không có thành tế bào và có kích thước rất nhỏ (200-300 nm) và có bộ gen nhỏ. Vì Mollicutes không thể sản xuất nhiều enzyme cần thiết để tồn tại nên chúng ký sinh trên tế bào nhân chuẩn. Acholeplasma Laylawii lần đầu tiên được phân lập từ nước thải thô ở London vào năm 1936. Chúng là những sinh vật hoại sinh phổ biến cũng như ở niêm mạc đường hô hấp trên và đường tiết niệu sinh dục của nhiều loài động vật và chim.
Do sự xuất hiện rộng rãi của nó trong tự nhiên, nó được coi là vi khuẩn gây ô nhiễm môi trường nuôi cấy tế bào phổ biến trong tất cả các loại môi trường nuôi cấy tế bào. Năm chất gây ô nhiễm nuôi cấy tế bào hàng đầu (95%) đã được xác định bao gồm: Mycoplasma orale, Mycoplasma arginini, Mycoplasma hyorinis, Mycoplasma fermentans, Acholeplasma Laylawii hoặc Mycoplasma hominis.
Kích thước nhỏ và cấu trúc lỏng của Mollicutes, do thiếu thành tế bào, giúp chúng có khả năng tránh khỏi các phương pháp phát hiện và kiểm soát thích hợp. Nhuyễn thể không có thành tế bào và có thể xuyên qua các bộ lọc khử trùng dưới áp suất cao bao gồm các bộ lọc 0,1 mm. Số lượng rất thấp có thể đi qua các bộ lọc khử trùng sẽ làm tăng khả năng ô nhiễm sẽ không được phát hiện trong quá trình thử nghiệm sau sản xuất. (Windsor, Windsor và Noordergraaf).
Bài viết này tìm cách đưa ra một cái nhìn tổng quan về các đặc điểm của Acholeplasma Laylawii, nhiều đặc điểm giống với Mycoplasmas và đề xuất các biện pháp có thể được sử dụng để đảm bảo phát hiện và kiểm soát chúng đúng cách.
ACHOLEPLASMA LAIDLAWII LÀ CHẤT GÂY Ô NHIỄM TIỀM ẨN?
Acholeplasma Laylawii có thể hiện diện trong các nguyên liệu thô có nguồn gốc tự nhiên, đặc biệt là các chất phụ gia dạng bột để nuôi cấy tế bào bao gồm huyết thanh bò và nước dùng đậu nành trypticase. Sự phát triển của A. laylawii trong môi trường mycoplasma cho thấy nó có nhu cầu dinh dưỡng tối thiểu. Việc gia tăng sử dụng khử trùng bộ lọc trong quá trình sản xuất (ngược lại với khử trùng bằng nhiệt) được coi là mối liên quan đã biết với sự gia tăng các trường hợp nhiễm Acholeplasma Laylawii .
Ô nhiễm Mycoplasma và Acholeplasma có thể mang lại sự thay đổi đặc tính trong nuôi cấy tế bào, dẫn đến khả năng các sản phẩm phụ của tế bào bị thay đổi và thậm chí cả dược phẩm sinh học bị tổn hại.
PHÒNG NGỪA ACHOLEPLASMA LAIDLAWII TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO?
Sự hiện diện của mycoplasmas, bao gồm cả A.Laylawii, trong nuôi cấy tế bào được thực hiện, một công nghệ đặc biệt của lĩnh vực công nghệ sinh học, có thể được thấy trong ước tính tỷ lệ ô nhiễm từ 15 đến 35% trong tất cả các quá trình nuôi cấy tế bào.
Phân lập Acholeplasma Laylawii thường ít liên quan đến việc sử dụng môi trường không có huyết thanh. Vì vậy, nếu có thể, có thể chọn môi trường không có huyết thanh. Các biện pháp phòng ngừa bổ sung bao gồm việc sử dụng nước khử trùng bằng nhiệt, thay vì nước lọc để hoàn nguyên bột có trong môi trường. Laidlaw và Elford nhận thấy rằng các mẫu cấy không thể chịu được nhiệt độ 55°C trong 5 phút và số lượng vi khuẩn giảm đáng kể sau 15 phút ở 45°C. Windsor, Windsor và Noordergraaf đã xác nhận những kết quả này trong đó tỷ lệ sống sót của Acholeplasma Laylawii giảm xuống 0 trong 20 phút ở 50°C và 60°C nhưng không ở nhiệt độ 40°C. Cũng theo những nhà nghiên cứu khác: “…hiện tại người ta vẫn chưa biết A. Laylawii làm thế nào trở thành vi khuẩn tiềm ẩn trong bột, hoặc nếu các loại bột tương tự (pepton hoặc albumen) là nguồn tiềm ẩn duy nhất của chất gây ô nhiễm này trong môi trường nuôi cấy tế bào không có huyết thanh.” Và, “Khả năng sinh vật này không tuân thủ các bộ lọc khử trùng và sau đó phát triển đến hiệu giá cao trong môi trường peptone hoặc các công thức môi trường nuôi cấy tế bào được bảo quản ở nhiệt độ lạnh có ý nghĩa nghiêm trọng đối với ngành công nghiệp dược phẩm sinh học.”
PHÁT HIỆN SỰ HIỆN DIỆN CỦA ACHOLEPLASMA LAIDLAWII TRONG NGÀNH DƯỢC PHẨM?
Việc kiểm tra các chất gây ô nhiễm trong môi trường sản xuất dược phẩm là yêu cầu chung của các cơ quan quản lý. Hướng dẫn cho xét nghiệm này được cung cấp trong Dược điển Hoa Kỳ (USP) <63> Xét nghiệm Mycoplasma , Dược điển Châu Âu (EP) Chương 2.6.7 Mycoplasmas, FDA 1993 Những điểm cần lưu ý (PTC) và Tiêu chuẩn 21 CFR 610.30 về xét nghiệm mycoplasma.
Các chất gây ô nhiễm loại Mycoplasma như Acholeplasma Laylawii có thể không được chú ý vì chúng vẫn không thể nhìn thấy được bằng mắt thường và kính hiển vi ánh sáng ngay cả ở độ chuẩn độ cao. Cần phải kiểm tra định kỳ để đảm bảo nuôi cấy tế bào không bị ô nhiễm và thậm chí các lô tiếp theo không bị nhiễm thêm từ lô bị ô nhiễm ban đầu. Các phương pháp phát hiện bao gồm: phát triển trực tiếp trên môi trường canh thang/thạch, nhuộm DNA cụ thể, PCR, ELISA, ghi nhãn RNA và quy trình enzyme.
Nói chung, có một số công nghệ có sẵn trên thị trường để phát hiện mycoplasma và mỗi công nghệ đều có những ưu điểm và nhược điểm liên quan. Danh mục bao gồm phạm vi bao quát rộng rãi về phát hiện Mollicute và tính đặc hiệu cho từng loài được phát hiện. Kết quả dương tính giả thấp cũng rất quan trọng. Các phương pháp bất lợi sẽ cho kết quả dương tính giả, tốn thời gian, công sức và thiếu tính đặc hiệu.
Dựa trên trình tự bộ gen hoàn chỉnh của Acholeplasma laylawii và các loài Mollicutes khác, các đầu dò PCR cho phép phát hiện chúng nhanh chóng và cụ thể. BIOFIRE ® Mycoplasma để phát hiện vi khuẩn Mycoplasma, bao gồm chất mồi cho A. Laylawii cũng như đầy đủ các Mollicutes khác. Việc chuẩn bị mẫu thử nghiệm và hiệu suất thử nghiệm rất đơn giản và tự động và có kết quả trong vòng chưa đầy một giờ.
BIỆN PHÁP KIỂM SOÁT BỔ SUNG NGĂN NGỪA ACHOLEPLASMA LAIDLAWII
Chandler, Volokhov và Chizhikov cho rằng A. Laylawii có thể dễ bị nhiễm pepton hơn Mycoplasmas nói chung và cần được loại trừ cụ thể.
Nói chung, vắc xin và các sản phẩm tái tổ hợp được sản xuất từ vi khuẩn hoặc nấm men chưa được thử nghiệm để tìm mycoplasma, chủ yếu là do các sinh vật sản xuất này phát triển nhanh chóng trong môi trường không được cho là sẽ hỗ trợ sự nhân lên của các mycoplasma phát triển chậm. Tuy nhiên, có một cảnh báo dựa trên các báo cáo gần đây rằng peptone (ví dụ, nước dùng đậu nành tryptone được khử trùng bằng cách lọc) được sử dụng trong môi trường nuôi cấy vi sinh và tế bào có thể bị nhiễm mycoplasmas sống, đặc biệt là A. Laylawii . Quan sát này cho thấy điều quan trọng là phải đánh giá cẩn thận tất cả các nguyên liệu thô về khả năng nhiễm mycoplasma hoặc có các quy trình tại chỗ giúp giảm thiểu nguy cơ nguyên liệu thô chứa mycoplasma còn sống, chẳng hạn như tiền xử lý nguyên liệu thô bằng bức xạ cực tím.
Các hướng dẫn kiểm soát ngành (hoặc các biện pháp kiểm soát) đưa ra các khuyến nghị về cách tốt nhất để kiểm soát hiệu quả Acholeplasma Laylawii, ví dụ như trong môi trường huyết thanh và các thành phần trong quy trình.
Chú trọng vào việc mua hàng có chọn lọc với chương trình quản lý nhà cung cấp được ghi chép, Thực hành sản xuất tốt (GMP), Phân tích mối nguy và Điểm kiểm soát quan trọng (HACCP), các chương trình tiên quyết và các hoạt động cải tiến liên tục mạnh mẽ.
Đây là những phương tiện mà tất cả các loài thực vật có thể sử dụng để hoàn thành mục tiêu giảm thiểu Acholeplasma Laylawii. Nhấn mạnh vào Thực hành mua nguyên liệu thô, Vận chuyển/Nhận thành phần, Cơ sở vật chất, Nhân viên và Khách đến thăm Nhà máy, Quy trình và Chính sách của Nhà máy (Vệ sinh và Làm sạch, Kiểm soát Dịch hại, Xử lý Vật liệu, Kiểm soát Bụi và Luồng không khí, Kiểm soát Độ ẩm), Bảo trì và Vận hành Thiết bị , Đóng gói, Bảo quản và Vận chuyển, Quy trình kiểm soát, Lấy mẫu và Phân tích.
NHỮNG NGÀNH CHUNG NÀO BỊ ẢNH HƯỞNG BỞI A. LAIDLAWII ?
A. Laylawii có ý nghĩa quan trọng đối với tất cả các lĩnh vực dược phẩm sinh học sử dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào.
GIẢI PHÁP VÀ SẢN PHẨM BIOMÉRIEUX
BIOFIRE ® Mycoplasma
BioFire ® Mycoplasma là một thiết bị nhỏ gọn, dễ sử dụng và hoàn toàn tự động, cung cấp khả năng phát hiện Mollicutes có độ nhạy cao và rộng rãi với thời gian thực hiện chưa đầy năm phút. Túi đựng thuốc thử dùng một lần tích hợp tinh chế axit nucleic và PCR đa kênh thời gian thực lồng nhau với thời gian chạy chưa đến một giờ và yêu cầu đào tạo cũng như kỹ năng vận hành ở mức tối thiểu.
15 xét nghiệm PCR khác nhau được đưa vào mỗi lần chạy để bao quát sự đa dạng di truyền rộng rãi của lớp Mollicutes, bao gồm các loài thuộc chi Acholeplasma, Entomoplasma, Mesoplasma, Mycoplasma, Phytoplasma, Spiroplasma và Ureaplasma. Ba biện pháp kiểm soát nội bộ đảm bảo độ tin cậy của kết quả bằng cách giám sát tất cả các khía cạnh của chức năng túi, từ trích xuất mẫu cho đến phát hiện khuếch đại.
Được thiết kế để đáp ứng các tiêu chuẩn thử nghiệm bổ sung, các nghiên cứu về Giới hạn Phát hiện (LoD) đã được thực hiện với trọng tâm đặc biệt là các loài được liệt kê trong dược điển Hoa Kỳ, Châu Âu và Nhật Bản sử dụng thể tích mẫu 0,2 mL và 10 mL. LoD cho 10 mL mẫu là ≤ 10 CFU/mL đối với tất cả các mycoplasma được thử nghiệm và chỉ yêu cầu một vài bước tiền xử lý đơn giản bằng cách ly tâm. Thử nghiệm trực tiếp 0,2 mL mẫu giúp phát hiện ≤ 33 CFU/mL và nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho việc giám sát thường xuyên hơn các nguyên liệu thô, ngân hàng tế bào, sản phẩm trung gian ban đầu và sinh phẩm có số lượng hạn chế như liệu pháp tế bào.
Minh Khang là nhà phân phối độc quyền giải pháp Dược phẩm hãng bioMérieux (Pháp).
EN