Công nghệ PCR từ Invisible Sentinel (bioMérieux) nhanh chóng, nhaỵ và có độ đặc hiệu cao – Công cụ lý tưởng dùng trong các phòng thí nghiệm của nhà máy bia.
Công nghệ PCR cho việc phát hiện các vi sinh vật lây nhiễm
Tất cả các vi sinh vật gây hư hỏng bia đều có DNA (axit Deoxyribonucleic) chứa các chỉ dẫn di truyền về sự phát triển và chức năng của sinh vật sống. Trong khi ở động vật, thực vật và nấm men, DNA được chứa trong nhân tế bào thì ở vi khuẩn, DNA có trong tế bào chất của chúng (vật liệu bên trong tế bào, được bao bọc bởi màng tế bào).
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một xét nghiệm đơn giản được phát minh vào năm 1983 bởi nhà hóa sinh người Mỹ Kary Mullis. Như cô ấy đã nêu trong tác phẩm năm 1990, PCR “cho phép chọn đoạn DNA với số lượng tuỳ ý. Chỉ cần một lượng nhỏ DNA để PCR tạo ra đủ bản sao để phân tích bằng các phương pháp phòng thí nghiệm thông thường. Qua đó, có thể thấy được PCR là một xét nghiệm có độ nhạy cao.
Ngày nay, nó là một phương pháp được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử và trong khi 5 năm trước, nó vẫn được coi là một công nghệ chỉ có thể tìm thấy ở các phòng thí nghiệm trung tâm lớn và các viện nghiên cứu do sự đầu tư cần thiết cả về thiết bị và quy trình vô trùng cụ thể, trong thời gian gần đây đã có sự đơn giản hóa các quy trình và thiết bị PCR (máy luân nhiệt), do đó cho phép công nghệ PCR được sử dụng như một công cụ sản xuất tại nhà máy bia và trong suốt quá trình sản xuất thực phẩm theo chuỗi.
DNA được tạo thành từ đâu?
Thông tin DNA được lưu trữ dưới dạng mã hoá được tạo thành từ 4 bazơ hóa học: adenine (A), guanine (G), cytosine (C) và thymine (T). Các bazơ DNA kết hợp với nhau, A với T và C với G, để tạo thành các đơn vị gọi là cặp bazơ. Mỗi bazơ cũng được gắn vào một phân tử đường và một phân tử photphat. Cùng với nhau, bazơ, đường và photphat được gọi là nucleotide. Các nucleotide được sắp xếp thành hai chuỗi dài tạo thành một vòng xoắn ốc gọi là chuỗi xoắn kép.
Một đặc tính quan trọng của DNA là nó có thể sao chép hoặc tạo ra các bản sao của chính nó. Mỗi chuỗi DNA trong chuỗi xoắn kép có thể đóng vai trò là khuôn mẫu để nhân đôi trình tự bazơ.
Quy trình hoạt động của PCR trong phát hiện vi khuẩn gây hỏng bia
1. Giải phóng DNA khỏi vi khuẩn hoặc nấm men
Mẫu được ly tâm để cô đặc “tế bào gây hỏng bia” trước khi thêm chất đệm để phá vỡ thành tế bào
2. DNA gây hỏng bia sau đó được thêm vào “dung dịch hỗn hợp” PCR có chứa tất cả các yếu tố cần thiết cho phản ứng (sự sao chép DNA) và được đặt trong Máy luân nhiệt.
3. Nhiệt độ cao được áp dụng để tách 2 chuỗi DNA (Biến tính) và sau đó giảm nhiệt độ cho phép các mồi đặc hiệu gây hỏng bia tìm kiếm mã DNA tương ứng của chúng và xếp hàng đối diện với chúng (Ủ).
4. Với các mồi đã vào đúng vị trí, enzyme (Enzym Polymerase) biết bắt đầu và kết thúc quá trình tổng hợp sợi mới ở đâu để tạo ra sợi đôi mới (Mở rộng). Và thế là 1 sợi trở thành 2 sau một chu kỳ đầy đủ. Các chu trình sau đó được lặp lại trong “Máy luân nhiệt”.
Khi kết thúc mỗi chu trình PCR, sản phẩm PCR hoặc khuếch đại sẽ tăng theo cấp số nhân vì các trình tự DNA mới được tổng hợp có thể được sử dụng làm mẫu (ngoài mẫu DNA ban đầu). Thông thường, 20 đến 30 chu kỳ PCR tiêu chuẩn là đủ để thúc đẩy mức tăng 106 đến 109 đoạn DNA.
5. Việc đọc các bộ khuếch đại tổng hợp PCR có thể diễn ra theo 2 cách:
a) PCR thời gian thực (qRT-PCR) dựa trên nguyên tắc lượng ban đầu cao hơn hoặc thấp hơn của một chuỗi DNA cụ thể (sự hiện diện của chất làm hỏng bia) sẽ dẫn đến nồng độ khuếch đại cao hơn hoặc thấp hơn tương ứng. Khi các bộ khuếch đại được tổng hợp, chúng được gắn thẻ bằng điểm đánh dấu huỳnh quang, sau đó có thể được “đọc” bằng máy đọc laze hoặc quang học và được giải thích theo phần mềm chu trình nhiệt để suy ra nồng độ của bộ khuếch đại.
Kết quả thường được biểu thị dưới dạng giá trị Ct, là số chu kỳ PCR mà tại đó đường cong phản ứng của mẫu của bạn giao với đường ngưỡng được thiết lập trước. Giá trị này cho biết cần bao nhiêu chu kỳ để phát hiện tín hiệu thực từ mẫu của bạn. Việc giải thích kết quả thường có thể khó khăn và cần có kinh nghiệm để khẳng định một cách đáng tin cậy liệu có nguy cơ hiện diện “bia làm hỏng” hay không.
b) End Stage PCR với tính năng đọc xét nghiệm nhanh cũng tương tự như đối với qRT-PCR dựa trên nguyên tắc rằng lượng ban đầu cao hơn hoặc thấp hơn của một chuỗi DNA cụ thể (sự hiện diện của chất làm hỏng bia) sẽ dẫn đến nồng độ khuếch đại cao hơn hoặc thấp hơn tương ứng. Sự khác biệt là một số lượng chu kỳ cố định được thực hiện và khi mỗi bộ khuếch đại được tổng hợp, thay vì gắn một điểm huỳnh quang vào nó, một dấu ấn sinh học được gắn vào, sau đó sẽ được phát hiện bởi một “kháng thể” cụ thể có trong xét nghiệm nhanh. Đối với “kiểm tra quan trọng”, kết quả là trực quan, mức độ cường độ của đường có thể được đo dựa trên điểm “tiêu chuẩn” để đưa ra mức bán định lượng của “tế bào gây hỏng bia” vốn đã có mặt ban đầu.
Thanh trùng bia và kiểm soát vi khuẩn gây hỏng bia bằng PCR
Mặc dù như đã đề cập ở trên, công nghệ PCR nhanh, nhạy và đặc hiệu khiến nó trở thành một công cụ lý tưởng cho phòng thí nghiệm của nhà máy bia, nhưng nó không thể phân biệt DNA từ tế bào sống với DNA từ tế bào chết. Đối với PCR, DNA là DNA. Đối với nhiều nhà máy bia thủ công, đây không phải là vấn đề, tuy nhiên đối với những nhà máy bia thủ công và công nghiệp thanh trùng bia của họ, việc sử dụng PCR sau thanh trùng (tức là trước khi đóng chai hoặc trên thành phẩm) có thể khiến người quản lý QC lo ngại khi một mẫu nào đó có kết quả dương tính.
Trong một số trường hợp, nhà sản xuất PCR sẽ đề xuất bước bổ sung sau thanh trùng ít nhất 24 giờ trước khi phân tích để nếu có DNA của tế bào chết, DNA sẽ bị pha loãng trong quá trình này và rõ ràng là sẽ không tăng. Tuy nhiên, thực hiện các bước sau kết quả PCR phụ thuộc vào mức độ ô nhiễm trước khi thanh trùng và thời gian mà DNA được giải phóng vẫn còn nguyên vẹn và điều này sẽ phụ thuộc vào nhiều biến số bia khác nhau (ví dụ: pH, nhiệt độ…).
Một cách tiếp cận khác là cho DNA tiếp xúc với một phân tử (ví dụ PMAxx TM– Biotium, Inc.) có ái lực cao với DNA và liên kết với nó nhưng không thể vượt qua tế bào sống sót để tiếp cận DNA bên trong trước khi khuếch đại. Sau khi được liên kết và tiếp xúc với bước sóng ánh sáng cụ thể, DNA “cố định” không thể nhân lên trong bước khuếch đại của PCR. Kết quả quan sát cuối cùng là dương tính, bạn biết rằng nó đến từ các tế bào sống và khả thi!
Những điểm chính
- Công nghệ Phản ứng chuỗi Polymerase (PCR) với khả năng phát hiện các chuỗi mã DNA cụ thể của các chất gây hỏng bia
- Trong 5 năm qua, PCR đã đơn giản hoá hơn để sử dụng
- Ngày nay, PCR được coi là một công cụ “định hướng sản xuất” thực sự vì khả năng cho kết quả trong cùng một ngày
- Có 2 cách tiếp cận công nghệ PCR (1) End Stage PCR: khuếch đại đoạn DNA đã chọn trong một số chu kỳ cố định rồi phân tích của kết quả (2) RT-PCR : trong quá trình khuếch đại, phân tích trong Thời gian thực sau mỗi chu kỳ của DNA hiện diện
- PCR cho phép thu được cả kết quả định tính và định lượng
- Kiểm soát chất lượng bia tiệt trùng sử dụng PCR yêu cầu một bước bổ sung để tránh xuất hiện “dương tính giả” đối với các tế bào sống
Nguồn: https://www.biomerieux-industry.com/es/node/1199
Minh Khang là nhà phân phối độc quyền giải pháp kiểm soát vi sinh vật trong bia hãng Invisible Sentinel/ BioMérieux (Pháp).
EN