Kính hiển vi kỹ thuật số để theo dõi hình ảnh tế bào sống
Để cung cấp độ tương phản và độ phân giải cần thiết cho việc phát hiện các đặc điểm trong hình ảnh tế bào sống, kính hiển vi phải có khả năng thu thập đủ ánh sáng từ mẫu vật để tạo ra nhiễu. Phần lớn các vật liệu sinh học, bao gồm cả tế bào động vật và thực vật, đều trong suốt với ánh sáng khả kiến, có rất ít đặc điểm màu sắc hoặc độ dốc đáng kể trong chỉ số khúc xạ có khả năng tạo ra độ tương phản. Do đó, hình ảnh các tế bào và mô sống chất lượng hay không phụ thuộc vào việc tăng cường độ tương phản bằng cách sử dụng các kỹ thuật quang học tiên tiến, chẳng hạn như độ tương phản nhiễu vi sai (DIC), độ tương phản điều chế Hoffman (HMC) và huỳnh quang. Khi thiết kế các thí nghiệm, phải xem xét nhiều khía cạnh tổng quát của cấu hình thiết bị. Chúng bao gồm kiểu khung kính hiển vi, thông số kỹ thuật của vật kính, nguồn chiếu sáng và hệ thống máy dò điện tử, cũng như các thiết bị phụ trợ như màng chắn, bánh xe kính lọc và buồng tạo ảnh.
Việc duy trì các tế bào sống trong tình trạng khỏe mạnh trong thời gian dài trên kính hiển vi đòi hỏi phải kiểm soát chặt chẽ nhiều biến môi trường, bao gồm nhiệt độ, không khí, độ ẩm, độ thẩm thấu và pH. Ngoài ra, để tạo ảnh tối ưu, các tế bào phải được đặt trong một buồng chuyên dụng có cửa sổ (lớp phủ) phù hợp với thiết kế vật kính và không hạn chế khẩu độ. Nhiều loại thiết bị ban đầu và thiết bị lồng ấp hậu mãi có sẵn trên thị trường cho mục đích này. Những phạm vi này từ các buồng Plexiglas lớn bao gồm toàn bộ giá đỡ kính hiển vi (xem Hình 1).
Cấu hình hình ảnh tế bào sống tổng quát dựa trên kính hiển vi nuôi cấy mô đảo ngược được trình bày trong Hình 1. Tất cả các thành phần phụ trợ được minh họa trong hình đều cần thiết để duy trì quá trình nuôi cấy trong khi thu được hình ảnh dưới trường sáng, độ tương phản pha, độ tương phản nhiễu vi sai và chiếu sáng huỳnh quang. Buồng mẫu được định vị trên giá đỡ cố định và thường được gắn chắc chắn trên lỗ mở phía trên vật kính. Duy trì môi trường buồng nuôi cấy là một lớp Plexiglas bao phủ hệ thống tụ điện của kính hiển vi, bàn soi, vật kính và đầu dò. Cảm biến carbon dioxide và van nạp khí được điều khiển bởi cùng một thiết bị giám sát nhiệt độ, trong khi các bộ phận bổ sung điều chỉnh bộ gia nhiệt giá đỡ và bộ gia nhiệt vật kính, giúp tránh tạo ra độ dốc nhiệt độ trong khu vực được tạo ảnh bằng dầu ngâm. Các bánh xe kính lọc kích thích và khí thải và hệ thống camera CCD được vận hành với một bộ điều khiển riêng biệt được giao tiếp với máy chủ. Tất cả các thiết bị phải được gắn trên breadboard. Cách ly khỏi nhiễu cơ học là cần thiết, nó cải thiện đáng kể độ phân giải hình ảnh. Sự rung từ máy ly tâm, máy trục, nồi hấp và máy nén trong tủ đông và tủ lạnh làm mờ hình ảnh khi được ghi.
Thông số vật kính
Thành phần quan trọng nhất đối với hình ảnh tế bào sống là vật kính của kính hiển vi và cần đặc biệt chú ý đến nhiều lựa chọn có sẵn. Trước tiên, cần xác định các yêu cầu về mẫu đối với ba tham số: khẩu độ số (NA), khoảng cách làm việc và độ phóng đại. Trong số này, khẩu độ số là tính năng quan trọng nhất vì giá trị này xác định giới hạn độ phân giải ngang và trục cũng như lượng ánh sáng thu được (thực tế là độ phân giải và độ tương phản khả dụng). Khẩu độ số vật kính nằm trong khoảng từ 0,1 đến 1,45 với các giá trị cao hơn tương ứng với khả năng phân giải cao hơn. Những vật kính được coi là khẩu độ số cao (lớn hơn 1,0) có khoảng cách làm việc ngắn (khoảng cách tiêu cự tối đa từ lớp phủ) và yêu cầu môi trường ngâm đặc biệt, chẳng hạn như nước, dầu hoặc glycerin, giữa thành phần thấu kính phía trước và lớp phủ. Khoảng cách làm việc thường bị bỏ qua trong lựa chọn khách quan, nhưng trở nên rất quan trọng để chụp ảnh các lát mô động vật và thực vật dày hơn. Độ phóng đại xác định độ lớn của mẫu vật, nhưng cũng có thể được coi là thước đo diện tích mẫu vật có thể xem được trong kính hiển vi. Nói chung, độ phóng đại tăng theo khẩu độ số và giảm khi khoảng cách làm việc lớn hơn.
Kính hiển vi được thiết kế từ giữa những năm 1990 sử dụng hệ thống quang học hiệu chỉnh vô cực hiện đại, thay thế chiều dài ống cố định (thường là 160 mm) vốn là thiết kế kính hiển vi chi phối rộng rãi trong hầu hết thế kỷ XX. Vật kính hiệu chỉnh vô cực thường có tính năng truyền ánh sáng cao hơn, khoảng cách làm việc dài hơn và không tương thích với kính hiển vi cũ hơn do yêu cầu phải có thấu kính dạng ống nằm ở nơi khác trong khung kính hiển vi. Các vật kính được hiệu chỉnh quang sai màu trên một phạm vi rộng từ một mặt phẳng tiêu cự duy nhất cho màu đỏ và xanh lá cây (achromats) đến sự hội tụ hoàn toàn của tím, xanh dương, xanh lá cây và đỏ (apochromats). Hệ số điều chỉnh trung gian cũng có sẵn. Ở mức hiệu chỉnh thấp nhất, tiêu sắc và thậm chí đối với một số vật kính tiêu sắc được hiệu chỉnh cao, vị trí lấy nét dọc trục của ánh sáng xanh lam và cực tím khác với ánh sáng lục và đỏ, ngay cả trong các vật kính có các vật thể có màu khác nhau cùng thẳng hàng ở mặt bên (x – y). Điều này dẫn đến các vấn đề nghiêm trọng khi xác định vị trí hoặc cường độ tương đối của hai đầu dò huỳnh quang hoặc khi tiến hành các thí nghiệm chụp ảnh tỷ lệ. Ngoài hiệu chỉnh màu sắc, quang sai hình cầu trong vật kính có thể được hiệu chỉnh để đạt được trường thị giác phẳng (gọi là điều chỉnh plan). Hầu như tất cả các vật kính hiện nay cũng được hiệu chỉnh để loại bỏ quang sai ngoài trục, chẳng hạn như coma và astigmatism.
Các nhà sản xuất kính hiển vi cung cấp nhiều loại vật kính có khẩu độ số, độ phóng đại và khoảng cách làm việc gần như giống nhau. Nói chung, những thiết kế vật kính này kết hợp sự cân bằng giữa hiệu suất truyền ánh sáng và hiệu chỉnh quang học tốt hơn hoặc bảo toàn sự phân cực ánh sáng. Các thành phần thấu kính thủy tinh bổ sung cần thiết để sửa quang sai màu và cầu có xu hướng làm giảm hiệu suất truyền dẫn (thực tế là giảm độ sáng). Ngược lại, các vật kính được thiết kế cho kính hiển vi huỳnh quang (được gọi một cách thích hợp là Fluor hoặc Fluar) truyền nhiều ánh sáng hơn trên dải quang phổ rộng hơn, nhưng thường được hiệu chỉnh kém đối với quang sai hình cầu và quang sai màu. Các vật kính được thiết kế cho ánh sáng truyền qua (DIC, HMC và độ tương phản pha) và các ứng dụng phân cực có thể được hiệu chỉnh cao, nhưng kém hiệu quả hơn đối với việc truyền ánh sáng. Các vật kính ánh sáng phân cực sử dụng các thành phần thủy tinh không bị biến dạng để bảo toàn góc phương vị của sự phân cực tuyến tính. Các vật kính tương phản pha chứa một vòng pha dày gần mặt phẳng tiêu cự phía sau chỉ ảnh hưởng một chút đến hiệu suất truyền dẫn (giảm 5 đến 15 phần trăm). Nói chung, các vật kính huỳnh quang là lựa chọn tốt nhất để chụp ảnh tế bào sống, trừ khi cần có DIC hoặc phân cực độ phân giải cao cho thí nghiệm.
Thiết kế quang học của nhiều vật kính đòi hỏi chúng phải được khớp cẩn thận với các lam kính có độ dày cụ thể (thường là 170 micromet), một giá trị thường được ghi trên vật kính (xem Hình 2). Hầu như tất cả các kính hiển vi được chế tạo cho khoa học đời sống đều được trang bị vật kính theo mặc định được hiệu chỉnh để sử dụng lớp phủ số 1,5 (dày 170 micromet). Đối với các thí nghiệm quan trọng, có sẵn các lam kính có thông số kỹ thuật rất nghiêm ngặt. Sử dụng lam kính số 1 hoặc 2 với các vật kính này có thể làm giảm đáng kể chất lượng hình ảnh, tùy thuộc vào hệ số phóng đại. Ngược lại, các vật kính ngâm (Hình 2(d)), không yêu cầu lam kính. Các vật kính này có đầu dò bằng gốm hoặc polyme tổng hợp và có thể được ngâm trực tiếp vào môi trường nuôi cấy (hoặc dung dịch đệm) trong khi làm việc với mẫu vật sống.
Các vật kính ngâm được thiết kế để chụp ảnh các mẫu vật mỏng được gắn vào lam kính. Nếu môi trường lỏng nằm giữa mẫu vật và lớp phủ, hoặc nếu chụp ảnh qua thể tích tế bào lớn hơn 20 micromet, đặc tính hội tụ ánh sáng của vật kính ngâm dầu bắt đầu suy giảm và tạo thêm nhiễu (ánh sáng hội tụ không đúng cách) cho hình ảnh. Mối lo ngại này thường được nhận ra khi chụp ảnh các lát mô dày và mẫu thực vật. Các vật kính và glycerin được phát triển cho các điều kiện như vậy vì chỉ số khúc xạ của môi trường ngâm ưa nước phù hợp chặt chẽ hơn với môi trường nuôi cấy và cytosol. Bất kể thực tế là các vật kính ngâm trong nước và glycerin có khẩu độ số thấp hơn (1,2 đến 1,3) so với các vật kính ngâm dầu (lên đến 1,45; xem Hình 2), tỷ lệ tín hiệu trên noise và độ phân giải của hình ảnh có thể được cải thiện đáng kể trong điều kiện hình ảnh tế bào trực tiếp. Hiệu chỉnh trường phẳng (plan) thường kém với các vật kính này, nhưng kính hiển vi đồng tiêu quét laze điển hình hoặc máy ảnh chụp ảnh ít hơn 2/3 trung tâm của trường quan sát, vùng mà hầu hết các vật kính đều có trường phẳng, bất kể hiệu chỉnh nhân tố. Trong trường hợp môi trường tạo ảnh chứa đủ các thành phần có trọng lượng phân tử cao để thay đổi đáng kể chỉ số khúc xạ, nước nên được thay thế bằng môi trường tạo ảnh nằm giữa lớp phủ và thành phần thấu kính phía trước (đối với vật kính ngâm trong nước) và vòng đệm hiệu chỉnh được sử dụng để hiệu chỉnh quang sai hình cầu
Tóm lại, một số hướng dẫn quan trọng nên được xem xét khi lựa chọn các ưu tiên khách quan cho hình ảnh tế bào sống. Trong mọi trường hợp, điều tra viên nên sử dụng vật kính có khẩu độ số cao nhất cho phép khoảng cách làm việc phù hợp để lấy nét thông qua các đặc điểm quan tâm trong mẫu vật. Ngoài ra, người ta nên chọn hệ số phóng đại sẽ chỉ chiếu vùng quan tâm từ mẫu lên máy dò. Nếu mẫu vật tiếp xúc trực tiếp với lớp phủ (như trường hợp nuôi cấy tế bào kết dính), vật kính ngâm dầu thường sẽ mang lại hiệu quả thu ánh sáng tối ưu. Trong trường hợp có môi trường lỏng giữa mẫu vật và lớp phủ, hoặc khi kính hiển vi phải được hội tụ qua một thể tích tế bào hoặc mô lớn, cả vật kính thông thường và vật kính ngâm nước thường tạo ra độ tương phản vượt trội ở độ phân giải gần như tương đương. Đối với các vật kính có vòng đệm hiệu chỉnh để loại bỏ quang sai hình cầu khi sử dụng các độ dày khác nhau của lớp phủ và phương tiện ngâm, cài đặt tối ưu phải được xác định cẩn thận. Ngoài ra, khi chụp ảnh các huỳnh quang đơn lẻ trong các tình huống tế bào sống, thường nên chọn một vật kính có tính năng truyền cao thay vì hiệu chỉnh màu mở rộng (điều này không cần thiết đối với chụp ảnh một màu). Cuối cùng, các ứng dụng yêu cầu bước sóng chiếu sáng ngắn (dưới 380 nanomet) hoặc dài (hơn 600 nanomet), cũng như ánh sáng phân cực, yêu cầu các vật kính chuyên dụng có vật liệu quang học vẫn trong suốt trên các vùng quang phổ này.
Hệ thống chiếu sáng
Trong hình ảnh tế bào sống, hệ thống chiếu sáng của kính hiển vi điển hình chứa nguồn sáng, màng chắn để xác định thời gian phơi sáng và bộ lọc để chọn cả cường độ ánh sáng và bước sóng. Mục tiêu của việc chiếu sáng các mẫu vật sống là tạo ra một trường đồng nhất về không gian, không đổi theo thời gian có các đặc điểm quang phổ xác định trong một khoảng thời gian chính xác. Trong kính hiển vi trường sáng (bao gồm các kỹ thuật tăng cường độ tương phản của DIC, HMC, và độ tương phản pha), các nguồn sáng bao gồm đèn vonfram-halogen truyền thống và điốt phát sáng (đèn LED). Các nguồn LED được giới thiệu gần đây cung cấp phổ ổn định hơn trong phạm vi cường độ của chúng và tạo ra ít nhiệt hơn so với đèn sợi đốt. Kính hiển vi huỳnh quang yêu cầu cường độ chiếu sáng mạnh hơn đáng kể, thường được cung cấp bởi đèn phóng điện hồ quang plasma hoặc chùm tia laze được quét. Đèn hồ quang plasma, sử dụng thủy ngân hoặc xenon làm nguồn hơi, tạo ra ánh sáng đủ để có thể chọn một dải bước sóng hẹp bằng cách sử dụng bộ lọc để kích thích huỳnh quang (xem Hình 3 và 4). Đầu ra từ nguồn xenon tương đối ổn định và chứa phổ bước sóng rộng, phẳng, cả hai đều quan trọng đối với các ứng dụng định lượng, chẳng hạn như phép đo cường độ và chụp ảnh tỷ lệ. Ngược lại, đèn hồ quang thủy ngân rất mạnh, nhưng bị nhấp nháy khi có phổ không đều. Đèn halogen kim loại mới hơn kết hợp một số tính chất tốt nhất của đèn xenon và đèn thủy ngân.
Đèn LED được xem như một công nghệ chiếu sáng tiềm năng cho hình ảnh tế bào sống. Các thiết bị bán dẫn linh hoạt này sở hữu tất cả các tính năng mong muốn của đèn hồ quang và đủ hiệu quả để được cấp nguồn bằng nguồn điện có thể chuyển đổi điện áp thấp, với tốc độ chuyển đổi có thể vượt xa tốc độ của các thiết bị cơ khí, chẳng hạn như bánh xe kính lọc. Đầu ra quang phổ đa dạng do đèn LED cung cấp giúp có thể chọn một nguồn sáng đi-ốt riêng lẻ để cung cấp dải bước sóng kích thích tối ưu cho các huỳnh quang bao trùm các vùng cực tím, khả kiến và cận hồng ngoại. Hơn nữa, các đèn LED công suất cao mới hơn tạo ra đủ cường độ để cung cấp nguồn chiếu sáng hữu ích cho nhiều ứng dụng trong kính hiển vi huỳnh quang, bao gồm chụp ảnh tế bào sống.
Cấu hình quang phổ cận tử ngoại, khả kiến và cận hồng ngoại của ba đèn plasma phóng điện hồ quang thường được sử dụng (thủy ngân, xenon và halogen kim loại) được minh họa trong Hình 3 cùng với hệ thống chiếu sáng xenon độc lập thương mại. Lưu ý sự giống nhau về đỉnh quang phổ giữa đèn thủy ngân và đèn halogen kim loại, nhưng cường độ tương đối tổng thể cao hơn do nguồn thứ hai thể hiện. Ngược lại, đèn xenon tạo ra quang phổ tương đối phẳng trong vùng khả kiến với một số cực đại nhỏ trong vùng hồng ngoại. Hệ thống chiếu sáng xenon được trình bày trong Hình 3 bao gồm đèn, vỏ, gương lạnh và nguồn điện, tất cả được chứa trong một bộ phận vận hành bên ngoài và được ghép nối với kính hiển vi bằng chất lỏng dẫn ánh sáng.
Kính hiển vi nhắm mục tiêu vào các ứng dụng chụp ảnh tế bào sống yêu cầu màng chắn cho hệ thống chiếu sáng để hạn chế sự tiếp xúc của mẫu vật với liều năng lượng ánh sáng có hại. Màng chắn hoạt động bằng cơ điện, được định thời gian phơi sáng chính xác, là công cụ tốt nhất để hạn chế thời gian chiếu sáng mẫu vật khi được sử dụng với các nguồn đèn hồ quang (được minh họa trong Hình 4(e)), nhưng các thiết bị này không cần thiết khi sử dụng các nguồn sáng LED mới hơn. Thời gian chiếu sáng bổ sung 0,5 giây dường như không đáng kể cho mỗi lần phơi sáng có thể gây ảnh hưởng đối với các thử nghiệm chụp ảnh tua nhanh thời gian trong thời gian dài. Nhiều loại màng chắn hậu mãi có sẵn trên thị trường với một số cấu hình để trang bị thêm cho cả đường dẫn quang truyền qua và huỳnh quang. Các thiết bị này dễ dàng được điều khiển bởi các gói điều khiển và mua lại phần mềm phổ biến có sẵn từ các công ty kính hiển vi hoặc nhà phân phối phụ kiện.
Chức năng chính của bộ lọc quang học là điều chỉnh độ sáng cho tần số ánh sáng (bước sóng hoặc màu sắc) và/hoặc cường độ trước khi chiếu tới mẫu vật. Cường độ của các nguồn chiếu sáng không phải laze (đèn hồ quang và đèn vonfram-halogen) nên được giảm bớt bằng các bộ lọc mật độ quang bất cứ khi nào có thể, và không thông qua việc điều chỉnh nguồn điện chạy đèn. Các bộ lọc mật độ quang thường là các đĩa thạch anh hoặc thủy tinh phủ kim loại giúp giảm cường độ ánh sáng mà không làm thay đổi đáng kể quang phổ màu. Mặc dù các bộ lọc cân bằng, rất lý tưởng cho nhũ tương film, vẫn thường được tích hợp vào kính hiển vi thương mại, nhưng chúng ít hữu ích hơn cho các ứng dụng hình ảnh kỹ thuật số hiện đại.
Các bộ lọc quan trọng nhất để nghiên cứu tế bào sống là các bộ lọc hồng ngoại (hoặc cắt nhiệt ) và tia cực tím, được lắp đặt giữa nguồn chiếu sáng và mẫu vật trong cả trường sáng và huỳnh quang. Đèn thủy ngân, xenon và vonfram-halogen tạo ra đủ bức xạ cực tím và hồng ngoại để làm hỏng mẫu vật, và trong nhiều trường hợp, ánh sáng có hại này không bị chặn bởi khối lọc huỳnh quang hoặc bộ phân cực được lắp vào đường quang học để tạo ảnh DIC. Chiếu sáng laze cho kính hiển vi đồng tiêu hoặc chiếu sáng LED cho kính hiển vi trường rộng không yêu cầu các bộ lọc này, nhưng định vị các khu vực cụ thể để tạo ảnh bằng cách sử dụng trường sáng không được lọc hoặc chiếu sáng huỳnh quang trên cùng một kính hiển vi có thể làm hỏng mẫu vật.
Các bộ lọc được thiết kế để chọn một luồng ánh sáng xác định (một số bước sóng giới hạn) để kích thích hoặc phát huỳnh quang được chế tạo bằng cách đặt các lớp vật liệu dày một phần tư bước sóng liên tiếp lên kính quang học. Sau đó, các đĩa lọc giao thoa này được gắn vào một bánh lọc hoặc trực tiếp vào một khối quang chuyên dụng thường được gọi là khối bộ lọc huỳnh quang ( xem Hình 4(a) và 4(b)). Sự chiếu sáng ở bất kỳ bước sóng đơn nào hoặc dải bước sóng hẹp nằm trong quang phổ kích thích dẫn đến một dải rộng các bước sóng huỳnh quang bao trùm toàn bộ quang phổ phát xạ (hiện tượng này được gọi là Quy tắc Kasha). Do đó, nên sử dụng bộ lọc kích thích thông dải hẹp (khoảng 10 đến 20 nanomet) để chụp ảnh tế bào sống của tế bào động vật có vú nhằm giảm thiểu quá trình tự phát huỳnh quang nền và trong tế bào thực vật để hạn chế kích thích fluorophores nội sinh và các phân tử cảm giác.
Minh họa trong Hình 4 là một số thiết bị hậu mãi hữu ích cho việc lựa chọn bước sóng trong kính hiển vi huỳnh quang, cũng như các thành phần bổ sung thường thấy trên kính hiển vi tự động được sử dụng trong chụp ảnh tế bào sống. Phổ của bộ lọc huỳnh quang được trình bày trong Hình 4(a) thể hiện mối quan hệ giữa các cấu hình truyền của các thành phần kích thích, bộ phát và gương lưỡng sắc. Các bộ lọc này thường được đặt tiện lợi trong một khối quang học (Hình 4(b)) cùng với các tổ hợp bộ lọc cho các huỳnh quang bổ sung. Hệ thống hình ảnh kênh kép (Hình 4(c)) và bánh xe bộ lọc 10 vị trí (Hình 4(d)) được thiết kế để nhanh chóng hoán đổi các bộ lọc kích thích hoặc phát xạ (bánh xe kính lọc) hoặc để thu thập đồng thời hình ảnh từ hai kênh bộ lọc. Hệ thống màng chắn (Hình 4(e)) và bàn sa trượt (Hình 4(f)) cho phép kỹ thuật viên hiển vi hạn chế chiếu sáng mẫu vật và dịch chuyển nhanh chóng từ vị trí bên này sang vị trí bên kia tương ứng. Điều khiển hướng trục với các giai đoạn tự động rất hữu ích trong nghiên cứu cần thiết cho nhiều cơ chế lấy nét tự động.
Máy dò cho hình ảnh tế bào sống
Hình ảnh hiện đại của các tế bào sống trong môi trường nuôi cấy chủ yếu dựa vào các máy dò mảng điện tử, bao gồm máy ảnh CCD, cũng như các máy dò nguồn điểm có độ khuếch đại cao, chẳng hạn như đèn nhân quang (PMTs). Mặc dù khác nhau về chi tiết kiến trúc, cả máy ảnh kỹ thuật số và bộ nhân quang đều là cảm biến tương tự được chế tạo trên một nguyên tắc chung. Các photon chiếu vào một chất nền quang hoạt được chuyển đổi thành các quang điện và cuối cùng được đọc ra dưới dạng dòng điện hoặc dòng điện áp tương tự. Số hóa tín hiệu, bằng cách tính gần đúng số lượng điện tử trong luồng tại các thời điểm cụ thể, tạo ra thước đo tương đối về cường độ ánh sáng, không bị tích lũy dần nhiễu vốn có trong việc lưu trữ dữ liệu tương tự. Bằng cách tương quan thời gian lấy mẫu với vị trí của phần tử mảng hoặc chùm tia được quét, các giá trị cường độ tương quan về mặt không gian để tạo lại hình ảnh của mẫu vật. Cài đặt máy dò mà người dùng có thể xác định thường bao gồm thời gian phơi sáng, tốc độ đọc, mức tăng, độ lệch và chọn vùng quan tâm (một phần của mảng) để đọc.
Trong tất cả các máy dò điện tử, việc tạo tín hiệu xảy ra khi các photon va chạm với chất nền hoạt động trên bề mặt máy dò. Thời gian phơi sáng và cường độ chiếu sáng xác định số lượng photon được tạo ra để tạo ảnh. Hiệu quả của việc chuyển đổi photon thành quang điện tử bị chi phối bởi tỷ lệ bề mặt máy dò có thể cảm nhận được photon (được gọi là hệ số lấp đầy trong CCD) kết hợp với hiệu suất lượng tử của chất nền. Hiệu suất lượng tử được định nghĩa là số lượng photon được chuyển đổi thành công chia cho tổng số lượng tác động đến chất nền. Ngoài ra, vật liệu của máy dò chắc chắn tạo ra một số electron giả, được gọi là dòng điện tối. Làm mát cảm biến hình ảnh, thường ở phạm vi từ -20 đến -80 độ C, sẽ triệt tiêu dòng tối khi cần thời gian phơi sáng lâu.
Sau khi được máy dò thu thập, tín hiệu và các điện tử dòng điện tối được đọc ra bộ chuyển đổi tương tự sang số (ADC). Việc đọc kết quả đầu ra của điện tử dẫn đến một hiện tượng gọi là nhiễu tín hiệu, xuất hiện từ các điện tử được tạo ra do nhiệt hoặc từ các lỗi thời gian nhỏ và cũng tỷ lệ thuận với tốc độ đọc. Cùng với nhau, dòng điện tối và nhiễu đọc được tạo thành các nguồn nhiễu chính trong quá trình ghi ảnh, ngoài bản chất thống kê của việc đếm photon. Phần mềm trình điều khiển cho nhiều máy ảnh kỹ thuật số cho phép lựa chọn tốc độ bộ khuếch đại đọc, thường được chỉ định bằng megahertz (MHz) hoặc pixel trên giây. Chọn tốc độ khung hình đọc nhanh hơn dẫn đến tỷ lệ tín hiệu trên tạp âm thấp hơn. Tương tự, trong kính hiển vi đồng tiêu, tốc độ quét chùm tia liên quan đến thời gian lấy mẫu của bộ nhân quang, thường có thể được thay đổi để tăng tín hiệu được đọc ra bộ chuyển đổi.
Ba biến thể cơ bản của kiến trúc CCD được sử dụng phổ biến cho các hệ thống hình ảnh khoa học: khung hình đầy đủ, truyền khung hình và truyền liên tuyến (minh họa trong Hình 5). Cảm biến hình ảnh full-frame (Hình 5(a)) có ưu điểm là gần 100% bề mặt là cảm quang, mặc dù nó phải được bảo vệ khỏi ánh sáng tới trong quá trình đọc (thường bằng màn trập cơ điện). CCD chuyển khung (Hình 5(b)) hoạt động nhanh hơn các thiết bị full-frame vì phơi sáng và đọc có thể xảy ra đồng thời. Mặc dù chúng tương tự như cấu trúc của các đối tác toàn khung hình, nhưng một nửa của mảng pixel hình chữ nhật được bao phủ bởi một lớp mờ đục được sử dụng làm bộ đệm lưu trữ cho các quang điện tử trước khi đọc. Ngược lại, CCD truyền giữa các dòng (Hình 5(c)) chứa các cột pixel hình ảnh đang hoạt động cùng với các pixel truyền lưu trữ được che phủ xen kẽ trên toàn bộ mảng. Bởi vì một kênh truyền điện tích được đặt ngay cạnh mỗi cột pixel cảm quang, nên điện tích được lưu trữ chỉ phải dịch chuyển trong một khoảng cách ngắn, giúp các chip này có tốc độ đọc nhanh nhất. Phần lớn các máy ảnh kỹ thuật số khoa học đơn sắc và màu được làm mát được trang bị cảm biến hình ảnh truyền giữa các dòng, tuy nhiên, các CCD nhân điện tử tiên tiến hơn thường chứa các chip chuyển khung.
Máy dò có 4 điện tử nhiễu hệ thống có thể sử dụng ít nhất bốn điện tử cho mỗi mức xám và sẽ yêu cầu dải đầu vào là 16.384 (4•(E12)) điện tử để được số hóa thành độ phân giải 12 bit. Lưu ý rằng đối với một số cảm biến hình ảnh (đặc biệt là CCD) có bộ chuyển đổi 12-bit (4096 mức xám), 14-bit (16.384 mức xám) hoặc thậm chí 16-bit (65.500 mức xám), vật liệu bộ dò hình ảnh có thể không đầy đủ. -Khả năng tốt để lấp đầy toàn bộ phạm vi đầu vào của bộ chuyển đổi tương tự sang số trong mọi trường hợp. Trong trường hợp này, bộ chuyển đổi tương tự tạo ra nhiều mức xám hơn mức tương ứng với các quang điện tử thực tế thu được từ máy dò. Điều này thường xảy ra với các hệ thống camera đơn sắc thương mại số hóa dữ liệu hình ảnh trên 10 bit.
Có thể khớp tín hiệu từ máy ảnh kỹ thuật số hoặc bộ nhân quang với dải đầu vào của bộ chuyển đổi tương tự sang kỹ thuật số bằng cách cài đặt cẩn thận các thông số khuếch đại và độ lệch, cũng như tốc độ bộ khuếch đại đọc. Ví dụ: nếu hai phần tử pixel liền kề đã thu thập 101 và 109 electron tương ứng được đưa vào bộ chuyển đổi 8 bit có phạm vi đầu vào là 2560 electron, thì sẽ cần 10 electron cho mỗi mức xám. Không có độ lợi điện tử, các pixel liền kề sẽ có các giá trị giống hệt nhau (mức thang độ xám là 10) trong hình ảnh cuối cùng. Nếu nhiễu máy dò kết hợp cho hệ thống này chỉ là 2 điện tử, thì số lượng 101 và 109 sẽ có thể phân biệt được. Áp dụng mức tăng 5 (một quá trình nhân) tạo ra 505 và 545 electron tương ứng, hiện được lấy mẫu thành các giá trị 50 và 54 bằng bộ chuyển đổi. Như vậy, bộ khuếch đại khuếch đại đã tăng sự khác biệt trong giá trị bộ dò sao cho giờ đây nó có thể được bộ chuyển đổi tương tự hiểu là các giá trị riêng biệt. Bởi vì, trong trường hợp giả định này, hệ số khuếch đại là 5 sẽ đẩy bất kỳ giá trị máy dò nào lớn hơn khoảng 500 ra khỏi phạm vi đầu vào của bộ chuyển đổi, điều khiển bù trừ có thể được sử dụng để trừ các điện tử trước khi số hóa. Trừ đi 400 electron trong ví dụ trên để lại 105 và 145 electron, được lấy mẫu thành các giá trị 10 và 14 trong hình ảnh thu được. Trong thực tế, bộ khuếch đại khuếch đại đưa ra nhiễu tương ứng với hệ số khuếch đại, hạn chế hệ số nhân hiệu quả.
Trong thực tế, nên điều chỉnh độ mở của máy dò và chiếu sáng để thu thập ánh sáng từ khu vực nhỏ nhất có thể của mẫu mà vẫn chứa thông tin cần thiết để nhận dạng đặc điểm và ngữ cảnh. Chụp ảnh một khu vực lớn hơn làm tăng khả năng tiếp xúc với ánh sáng của mẫu vật và kéo dài thời gian đọc của cảm biến. Đối với máy ảnh kỹ thuật số, khu vực đọc có thể được đặt bằng cách sử dụng gói phần mềm đi kèm để kiểm soát việc thu thập. Cũng nên tính đến việc khớp độ phân giải của vật kính với độ phân giải của cảm biến hình ảnh. Kính hiển vi đồng tiêu quét laser cũng cho phép các khu vực có thể lựa chọn bằng phần mềm để thu nhận hình ảnh, được ngụy trang khéo léo dưới dạng thu phóng. Khi sử dụng tính năng này, hãy lưu ý đến sự tương tác giữa hệ số thu phóng và tốc độ lấy mẫu không gian, thường được phần mềm kính hiển vi để tính toán lại. Trong trường hợp việc chọn một khu vực nhỏ để chụp ảnh không làm thay đổi số lượng mẫu (pixel) một cách tương ứng, thì mục tiêu rút ngắn thời gian chiếu sáng và thời gian đọc sẽ không đạt được. Trong tình huống này, nên đặt lại kích thước hình ảnh với tốc độ lấy mẫu, lưu ý đến giới hạn độ phân giải của vật kính.
Máy dò cho hình ảnh hiện đại
Mặc dù các nguyên tắc cơ bản giống nhau áp dụng cho hầu hết các máy dò thường được sử dụng trong kính hiển vi quang học, nhưng các triển khai thương mại khác nhau rõ rệt. Tính năng thiết kế chính của máy ảnh dựa trên CCD là nó lưu trữ các electron trong quá trình phơi sáng mang lại dải động đặc biệt. Thời gian phơi sáng và tốc độ đọc là các thông số quan trọng. Các phần tử cảm biến CCD (điốt quang) mô phỏng việc thu thập quang điện tử, bắt đầu với số không điện tử và lấp đầy đến điểm bão hòa xác định, được gọi là công suất đầy đủ của giếng. Trong các hệ thống camera hiện đại, độ sâu giếng phù hợp chặt chẽ với phạm vi đầu vào của bộ chuyển đổi tương tự sang kỹ thuật số, loại trừ yêu cầu đối với các thông số bù và khuếch đại do người dùng kiểm soát. Ngoài ra, tốc độ bộ khuếch đại đọc có thể lựa chọn cho phép thỏa hiệp giữa tín hiệu nhiễu và tốc độ khung hình tối đa.
Một ưu điểm nữa của máy ảnh kỹ thuật số là hiệu suất lượng tử cao của các hệ thống cấp độ nghiên cứu. Hơn nữa, sự hồi qui tuyến tính vượt trội cho phép tín hiệu đầu ra tương quan chặt chẽ với số lượng photon trên toàn bộ dải động. Những lợi thế quan trọng của camera CCD được khai thác trong ba khái niệm cơ bản:
- Phơi sáng lâu có thể được sử dụng để thu thập ánh sáng từ nguồn tín hiệu yếu để phát hiện.
- Phạm vi động cho phép ghi lại sự khác biệt về độ tương phản cục bộ trong các đặc điểm sáng và tối trong cùng một hình ảnh.
- Hồi quy tuyến tính giúp đơn giản hóa phép trừ nền và tính toán cần thiết cho các ứng dụng định lượng.
Theo truyền thống, một camera video đã đề cập đến một thiết bị ống chân không, trong khi hệ thống kỹ thuật số được dành riêng cho các hệ thống hình ảnh trạng thái rắn (CCD) hiện đại. Camera video điển hình với tốc độ cao, có thể xuất 30 khung hình mỗi giây. Camera video có thể được sử dụng cho kính hiển vi trường sáng, nhưng các đánh giá định lượng về sự khác biệt cường độ tương đối có thể bị cản trở bởi các mạch tự động khuếch đại hoặc hiệu chỉnh gamma và trong một số trường hợp, hình ảnh bị biến dạng hình học do kích thước pixel không vuông.
Máy ảnh kỹ thuật số đủ màu phân tách các phần màu đỏ, lục và lam (RGB) của quang phổ khả kiến thành các hình ảnh riêng biệt và trộn chúng lại với nhau sau khi phơi sáng để mô phỏng màu. Tỷ lệ camera kết hợp mask màu được in trên CCD cảm biến hình ảnh, làm giảm độ phân giải theo hệ số lớn hơn 3. Các máy ảnh màu tiên tiến hơn hoặc thu thập ba hình ảnh liên tiếp bằng cách sử dụng bánh xe kính lọc (hoặc bộ lọc có thể điều chỉnh tinh thể lỏng; LCTF) để chọn màu hoặc có ba chip cảm biến được ghép nối với cơ chế phân chia ánh sáng tới thành các kênh màu đỏ, lục và lam để thu nhận đồng thời. Việc áp dụng máy ảnh màu để chụp ảnh tế bào sống, ngoại trừ trong những trường hợp rất chuyên biệt, đã bị cản trở do thiếu tốc độ thu nhận, độ nhạy, dải động và độ phân giải. Các trường hợp ngoại lệ đáng chú ý là các camera đa chip được thiết kế mới đã được chứng minh là hữu ích trong các nghiên cứu về hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET).
Tóm lại, trong vài năm tới, các nhà kính hiển vi có thể sẽ gặp rất nhiều hệ thống phát hiện mới sử dụng công nghệ tiên tiến. Ví dụ: máy ảnh sử dụng cảm biến hình ảnh bán dẫn oxit kim loại bổ sung (CMOS) đã thay thế nhiều công nghệ CCD trên thị trường tiêu dùng, nhưng hiệu suất lượng tử kém (khoảng 25%), hệ số lấp đầy và nhiễu ngẫu nhiên (một hiện tượng được tạo ra bởi nhiều bộ khuếch đại độc lập trong mỗi pixel) hiện hạn chế tính hữu dụng trong các ứng dụng ánh sáng yếu cho công việc khoa học. Máy ảnh CCD tăng cường (được gọi là ICCD) bao gồm một dãy các bộ nhân quang siêu nhỏ được lắp đặt trong một tấm vi kênh, thường được hợp nhất với chip cảm biến. Tấm vi kênh giới hạn độ phân giải không gian và hồi quy tuyến tính, nhưng cung cấp khả năng phát hiện tín hiệu cao khi tốc độ khung hình cao là rất quan trọng. Máy ảnh CCD nhân điện tử (EMCCDs; Hình 6) có bộ khuếch đại khuếch đại được tích hợp trong chip CCD, cho phép nhân các electron tín hiệu trước khi thêm nhiễu tín hiệu. Những loại camera này đang phổ biến trong lĩnh vực hình ảnh tế bào sống, cung cấp tất cả các ưu điểm cơ bản của một máy ảnh khoa học tiêu chuẩn, với đặc tính bổ sung là cần ít chuyển đổi quang điện tử hơn trước khi bộ chuyển đổi tương tự có thể chuyển đổi tín hiệu thành tín hiệu dải động có thể sử dụng được. Các lựa chọn thay thế ở trạng thái rắn cho bộ nhân quang đã được sử dụng trong nhiều năm và bao gồm các đơn vị CCD chuyên dụng và đi-ốt quang bán dẫn.
Nguồn: https://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/livecellimaging/imagingsystems.html
Công ty Minh Khang là nhà phân phối độc quyền thị trường miền Nam phân khúc kính hiển vi hãng Carl ZEISS.
EN