Kính hiển vi huỳnh quang của Zeiss mang lại hệ thống quang học tuyệt vời, sử dụng hiệu ứng phát huỳnh quang của vật mẫu để tạo ra hình ảnh có độ sắc nét cao.
Giới thiệu
Kính hiển vi huỳnh quang được thiết kế phải đảm bảo rằng các tập hợp các tia sáng phải được truyền chính xác. Kiểm soát sự chiếu sáng là quan trọng nhất để đạt được hình ảnh chất lượng cao trong kính hiển vi và hình ảnh kỹ thuật số. Việc thiếu độ sáng không phải là thách thức đối với kính hiển vi trường sáng, nhưng nếu sử dụng các kỹ thuật tăng cường độ tương phản, chẳng hạn như độ tương phản pha, độ tương phản giao thoa vi sai, huỳnh quang hoặc độ tương phản phân cực, thì các phần tử quang học bổ sung tiêu thụ một phần đáng kể luồng ánh sáng khả dụng sẽ được đưa vào đường đi của chùm tia. Điều này sẽ dẫn đến việc có ít ánh sáng để quan sát và kết quả là hình ảnh có đặc điểm tối. Khi được điều chỉnh hợp lý, ánh sáng từ tụ quang sẽ lấp đầy mặt phẳng tiêu cự phía sau của vật kính bằng ánh sáng tạo ảnh bằng cách chiếu một hình nón ánh sáng để chiếu sáng trường nhìn. Màng chắn khẩu độ của tụ quang chịu trách nhiệm kiểm soát góc của hình nón ánh sáng và do đó, khẩu độ số của tụ quang. Khái niệm này được minh họa trong Hình 1, trong đó một loạt tụ quang được minh họa bằng hình nón ánh sáng (và khẩu độ số) có kích thước giảm dần từ trái sang phải như trong hình.
Một lý do khác cho sự xuất hiện của các màng chắn, lăng kính, bộ tách chùm tia và bộ lọc cố định và có thể điều chỉnh trong kính hiển vi là do độ sáng thường phải được đặt lại sau mỗi lần thay đổi vật kính. Điều này một phần là do kích thước của trường mẫu vật được quan sát thay đổi theo mọi độ phóng đại của vật kính. Vật kính có độ phóng đại thấp (ví dụ: 4x) cung cấp trường quan sát lớn (với đường kính lớn tới 5 mm trong trường hợp này, với điều kiện là thị kính cho phép quan sát hình ảnh trung gian có đường kính 20 mm). Nếu chuyển sang vật kính 40x, đường kính của trường quan sát của mẫu sẽ co lại theo hệ số 10 (chỉ còn 0,5 mm). Vùng có thể xem sau đó trở nên nhỏ hơn gấp 100 lần. Lý do thứ hai là khẩu độ số tăng từ 0,12 lên 0,65 hoặc, thể hiện dưới dạng góc khẩu độ, từ 15 độ đến 80 độ. Ảnh hưởng của khẩu độ số đối với kích thước và hình dạng nón ánh sáng chiếu sáng được trình bày trong Hình 1.
Có rất nhiều nguồn sáng sẵn có để chiếu sáng kính hiển vi, cho cả quan sát thông thường và chụp ảnh kỹ thuật số định lượng. Nguồn sáng phổ biến nhất, do chi phí thấp và tuổi thọ cao, là đèn halogen-vonfram 30 đến 100 watt. Những đèn này tương đối sáng với phổ màu tập trung ở 3200 Kelvin (khi được đặt gần với điện áp danh định của đèn), nhưng yêu cầu các bộ lọc chuyển đổi màu để nâng nhiệt độ màu của chúng lên mức tương đương với ánh sáng ban ngày. Một nguồn sáng phổ biến khác là đèn phóng điện hồ quang xenon 75 đến 150 watt vì độ sáng rất cao và tuổi thọ cao. Đèn xenon có cường độ đầu ra tương đối đồng đều trên quang phổ thị giác và nhiệt độ màu xấp xỉ ánh sáng ban ngày. Khi cần cường độ ánh sáng rất cao, đèn halogen kim loại và đèn thủy ngân, cũng như laser thường được sử dụng. Trong kính hiển vi huỳnh quang, đặc biệt với mục đích chụp ảnh kỹ thuật số, đèn đốt thủy ngân 100 watt hoặc 200 watt đã được sử dụng trong nhiều thập kỷ qua. Những loại đèn này đang dần bị thay thế bởi đèn halogen kim loại ổn định hơn, tuổi thọ và cường độ cao hơn trong các vùng liên tục. Càng ngày, điốt phát quang (Đèn LED ) được sử dụng làm nguồn chiếu sáng kính hiển vi cho ánh sáng truyền qua cũng như huỳnh quang.
Nhiều năm trước, đèn hồ quang carbon hoặc bóng đèn zirconium đã được sử dụng để đạt được mức độ chiếu sáng cao, nhưng ngày nay đèn ít sử dụng vì nó làm giảm chất lượng và độ đồng nhất của ánh sáng truyền tới mẫu. Hệ thống chiếu sáng của Köhler khắc phục được nhiều hạn chế gặp phải với các nguồn sáng nóng và phóng điện hồ quang bằng cách tạo ra các chùm tia song song đi qua mẫu vật. Kỹ thuật chiếu sáng Köhler chỉ yêu cầu trường nhìn của mẫu được chiếu sáng, vì ánh sáng quá mức bên ngoài trường nhìn chứa ánh sáng tán xạ làm giảm độ tương phản. Đồng thời, một trong những khía cạnh quan trọng nhất của kính hiển vi là hình nón ánh sáng của nguồn sáng phải luôn khớp với khẩu độ góc của vật kính để cho phép sử dụng hiệu quả toàn bộ khẩu độ của quang học.
Hệ thống quang học và nhiều thành phần khác của kính hiển vi hiện đại được trình bày trong Hình 2. Bộ tụ quang (chứa màng khẩu độ) và màng trường sáng thường có trong chân đế là những yếu tố quan trọng để đạt được sự chiếu sáng của Köhler. Các tia sáng tạo ảnh đi qua mẫu vật được chụp bởi vật kính của kính hiển vi và hướng vào thị kính và/hoặc đến một trong số các cổng camera. Xuyên suốt hệ thống quang học của kính hiển vi, sự chiếu sáng được định hướng và tập trung thông qua các màng chắn và thấu kính khi nó di chuyển từ nguồn sáng để chiếu sáng mẫu vật và sau đó đi vào thị kính hoặc phụ kiện máy ảnh. Việc đóng hoặc mở màng ngưng tụ điều khiển góc của các tia sáng đi ra khỏi tụ quang và chiếu tới mẫu vật từ tất cả các góc phương vị. Do nguồn sáng không tự động hội tụ tại mẫu vật, nên sự chiếu sáng mẫu vật về cơ bản là không có hạt và được mở rộng (thực tế là tạo ra trường chiếu sáng đồng nhất) và không bị giảm chất lượng do bụi và các lỗi trên bề mặt thủy tinh của tụ quang. Cài đặt màng khẩu độ của tụ quang, cùng với khẩu độ số của vật kính, xác định khẩu độ số thực hiện được của toàn bộ hệ thống kính hiển vi. Màng ngăn trường phát sáng xác định phần và kích thước của mẫu vật được chiếu sáng. Màng chắn khẩu độ của tụ quang được tạo ảnh trên vòng tròn thị kính và điều chỉnh độ chiếu sáng của nó. Toàn bộ hệ thống quang học được thiết kế sao cho các góc khẩu độ của nón ánh sáng được đặt chính xác cùng với màng khẩu độ.
Các mặt phẳng liên hợp trong kính hiển vi
Kính hiển vi chứa hai nhóm mặt phẳng quang học xen kẽ khác nhau chịu trách nhiệm kiểm soát sự chiếu sáng và hình ảnh. Nói chung, các mặt phẳng quang học này được gọi là các mặt phẳng liên hợp. Nhóm mặt phẳng đầu tiên (được gọi là mặt phẳng khẩu độ ) điều khiển đường chùm tia để chiếu sáng và tạo ra hình ảnh hội tụ của dây tóc đèn ở mặt phẳng của màng chắn khẩu độ tụ điện, mặt phẳng tiêu điểm phía sau của vật kính và điểm mắt (còn gọi là đĩa Ramsden) của thị kính. Các mặt phẳng liên hợp nằm trong tiêu điểm chung và rất quan trọng để đạt được độ rọi Köhler thích hợp. Một tập hợp thứ hai của các mặt phẳng, được gọi là mặt phẳng liện hợp tạo ảnh bao gồm màng chắn trường, tiêu bản, màng cố định của thị kính và võng mạc của mắt hoặc bề mặt của máy dò ảnh. Theo định nghĩa, một vật thể được lấy nét tại một mặt phẳng cũng được lấy nét tại các mặt phẳng liên hợp khác của đường đi ánh sáng đó. Trong mỗi đường đi của ánh sáng (cả tạo ảnh và chiếu sáng) đều có 4 mặt phẳng riêng biệt cùng nhau tạo nên tập mặt phẳng liên hợp.
Khi xem xét, các mặt phẳng liên hợp trên đường đi của các tia sáng chiếu sáng trong chiếu sáng Köhler (Hình 3(a)) bao gồm:
- Dây tóc đèn.
- Màng chắn khẩu độ của tụ quang (ở mặt phẳng tiêu cự phía trước của tụ quang).
- Mặt phẳng tiêu cự phía sau của vật kính.
- Điểm mắt (còn gọi là đĩa Ramsden) của thị kính, nằm ở phía trên thấu kính trên cùng của thị kính khoảng 1/2 inch (một cm), tại điểm mà người quan sát đặt phía trước mắt trong khi quan sát.
Tương tự, các mặt phẳng liên hợp trong đường ánh sáng tạo ảnh trong chiếu sáng Köhler (Hình 3(b)) bao gồm:
- Màng chắn trường sáng
- Các mẫu vật tập trung.
- Mặt phẳng ảnh trung gian (tức là mặt phẳng của màng chắn cố định của thị kính).
- Đổng tử của mắt, mặt phẳng film hoặc bề mặt cảm biến hình ảnh của máy ảnh.
Các mặt phẳng tiêu điểm liên hợp thường hữu ích trong việc khắc phục sự cố kính hiển vi về bụi bẩn, sợi và các lỗi trong các hệ thống quang học. Nếu những thành phần này được lấy nét rõ nét, thì theo đó chúng phải nằm trên hoặc gần một bề mặt là một phần của tập hợp các mặt phẳng liên hợp tạo thành hình ảnh. Chúng bao gồm phần tử thủy tinh ở cổng ánh sáng của kính hiển vi, mẫu vật, đường chữ thập trong thị kính và phần tử thấu kính phía dưới của thị kính. Ngoài ra, nếu các chất nhiễm bẩn làm mờ và mất nét, có thể tìm thấy chúng gần tập hợp các phần tử chiếu sáng có chung các mặt phẳng liên hợp như ở thấu kính tụ quang (nơi bụi bẩn thường tích tụ), thành phần thấu kính thị kính lộ ra ngoài (từ lông mi) và thấu kính phía trước vật kính (thường là dấu vân tay).
Gần như toàn bộ kính hiển vi (nếu không tính đến việc chuẩn bị mẫu vật) phụ thuộc vào việc sử dụng đúng trường phát sáng và màng khẩu độ. Phần tiếp theo sẽ mô tả chi tiết cách đặt chính xác kính hiển vi để chiếu sáng Köhler. Kỹ thuật này được khuyến nghị bởi tất cả các nhà sản xuất kính hiển vi trong phòng thí nghiệm hiện đại vì nó có thể tạo ra sự chiếu sáng mẫu vật sáng đồng đều và không bị lóa. Sẽ dễ dàng hơn nếu đã làm quen với mối tương quan giữa các mặt phẳng liên hợp. Các mặt phẳng khẩu độ (còn được gọi là vòng tròn thị kính) chịu trách nhiệm phân giải năng lượng và các kỹ thuật tương phản và có thể được kiểm soát bằng các bộ lọc ánh sáng và cài đặt màng chắn. Ngược lại, các mặt phẳng trường chứa hình ảnh được tạo bởi các thành phần quang học của kính hiển vi và là nơi chứa các ô và thang đo được sử dụng để đo độ dài. Các mặt phẳng trường được điều khiển thông qua màng chắn trường.
Màng chắn trường ở chân đế của kính hiển vi chỉ kiểm soát độ rộng của chùm tia sáng truyền tới tụ quang. Khẩu độ thay đổi này không ảnh hưởng đến độ phân giải quang học, khẩu độ số hoặc cường độ chiếu sáng. Việc điều chỉnh đúng cách của màng trường (trên thực tế, được căn giữa trong đường quang học và được mở sao cho nằm ngay bên ngoài trường nhìn) là rất quan trọng để ngăn ánh sáng chói hơn là có thể làm giảm độ tương phản trong hình ảnh được quan sát. Việc loại bỏ ánh sáng dư thừa đặc biệt quan trọng khi cố gắng tạo ảnh các mẫu có độ tương phản thấp vốn có. Khi màng trường mở quá xa, ánh sáng phân tán phát ra từ mẫu vật và ánh sáng phản xạ ở các góc xiên từ các bề mặt quang học có thể làm giảm chất lượng hình ảnh.
Bộ phân cực ánh sáng thường được gắn trực tiếp bên dưới chân đế kính hiển vi, có thể nâng lên hoặc hạ xuống độc lập với bệ đỡ được gắn trực tiếp bên dưới bàn sa trượt của kính hiển vi có thể nâng lên hoặc hạ xuống một cách độc lập với chân đế bằng cách xoay núm chỉnh độ sáng. Màng chắn khẩu độ được mở và đóng bằng núm xoay hoặc bằng cách xoay vòng đệm trên hộp tụ quang. Cần lưu ý rằng việc điều chỉnh chính xác bộ phân cực ánh sáng có lẽ là khía cạnh quan trọng nhất để đạt được độ chiếu sáng Köhler phù hợp. Tuy nhiên, sự sai lệch của tụ quang và các màng khẩu độ của tụ quang được điều chỉnh không đúng cách là nguyên nhân chính dẫn đến hình ảnh và chất lượng chụp ảnh kém.
Kính hiển vi huỳnh quang truyền ánh sáng phản xạ
Kính hiển vi huỳnh quang truyền ánh sáng phản xạ thường được gọi là kính hiển vi với ánh sáng chiếu tới, chiếu sáng epi hoặc kính hiển vi kim tương, và là phương pháp được lựa chọn để phát huỳnh quang và chụp ảnh các mẫu mờ ngay cả ở độ dày 30 micron. Phạm vi mẫu vật thuộc loại này là rất lớn và bao gồm hầu hết các kim loại, quặng, gốm sứ, nhiều polyme, chất bán dẫn (silicon chưa qua xử lý, tấm mỏng và mạch tích hợp), xỉ, than, nhựa, sơn, giấy, gỗ, da, thủy tinh và nhiều loại vật liệu chuyên dụng. Bởi vì ánh sáng không thể xuyên qua các mẫu vật này, nên nó phải được chiếu trực tiếp lên bề mặt và cuối cùng quay trở lại vật kính của kính hiển vi bằng phản xạ gương hoặc phản xạ khuếch tán. Như đã đề cập ở trên, sự chiếu sáng như vậy thường được gọi là chiếu sáng episcopic, chiếu sáng epi hoặc chiếu sáng dọc (về cơ bản bắt nguồn từ phía trên), trái ngược với chiếu sáng (truyền) qua kính thiên văn đi qua mẫu vật.
Ngày nay, nhiều nhà sản xuất kính hiển vi cung cấp các mẫu tiên tiến cho phép người dùng đồng thời tiến hành điều tra bằng cách sử dụng cả chiếu sáng dọc và chiếu ánh sáng truyền qua. Một kính hiển vi điển hình được cấu hình cho cả hai loại chiếu sáng được minh họa trong Hình 4 (nguồn sáng truyền qua và đường quang học không được hiển thị trong hình minh họa này). Hệ thống quang học cho ánh sáng phản xạ bắt đầu bằng các tia sáng bắt nguồn từ vỏ đèn cho ánh sáng phản xạ (Hình 4). Tiếp theo, ánh sáng này đi qua thấu kính và đi vào đèn chiếu sáng dọc, nơi nó được điều khiển bởi khẩu độ và màng chắn trường. Sau khi đi qua đèn chiếu sáng dọc, sau đó ánh sáng được phản xạ bởi một bộ tách chùm tia (một nửa gương hoặc gương có bề mặt thứ nhất có hình elip) qua vật kính để chiếu sáng mẫu vật. Ánh sáng phản xạ từ bề mặt của mẫu đi vào lại vật kính và đi vào đầu ống kính nơi nó được hướng tới thị kính hoặc tới một cổng để chụp ảnh hiển vi. Kính hiển vi huỳnh quang truyền ánh sáng phản xạ thường là lĩnh vực của các ứng dụng công nghiệp, đặc biệt là trong lĩnh vực bán dẫn đang phát triển nhanh chóng, và do đó đại diện cho một phần quan trọng nhất của nghiên cứu kính hiển vi.
Một kính hiển vi huỳnh quang truyền ánh sáng phản xạ hợp chất thẳng đứng điển hình có hai ống quan sát thị kính (Hình 4) và thường là một đầu ống ba mắt để gắn hệ thống camera thông thường hoặc kỹ thuật số/video. Thị kính của thiết bị tiêu chuẩn thường có độ phóng đại 10 lần và hầu hết các kính hiển vi đều được trang bị một đầu dò có khả năng chứa từ 4-6 vật kính. Bàn soi được điều khiển cơ học với giá đỡ mẫu vật có thể dịch theo hướng x và y và toàn bộ thiết bị bàn soi có khả năng di chuyển lên xuống chính xác với cơ chế lấy nét thô và tinh. Các nguồn sáng tích hợp có phạm vi từ bóng đèn halogen vonfram 20 và 100 watt đến đèn hơi thủy ngân hoặc đèn xenon năng lượng cao hơn được sử dụng trong kính hiển vi huỳnh quang. Ánh sáng đi từ hộp sáng qua một đèn chiếu sáng thẳng đứng xen kẽ phía trên ống kính nhưng bên dưới mặt dưới của đầu ống quan sát. Bề mặt trên của mẫu vật thẳng đứng (thường không có lớp phủ) trên bệ đối diện với vật kính, đã được quay vào trục quang học của kính hiển vi. Đèn chiếu sáng thẳng đứng được định hướng theo chiều ngang một góc 90 độ so với trục quang học của kính hiển vi và song song với mặt bàn, với vỏ đèn được gắn vào mặt sau của đèn chiếu sáng. Các núm điều chỉnh thô và tinh tăng hoặc giảm giá đỡ theo từng bước lớn hoặc nhỏ để đưa mẫu vật vào tiêu cự sắc nét. Đèn chiếu sáng thẳng đứng được định hướng theo chiều ngang một góc 90 độ so với trục quang học của kính hiển vi và song song với mặt bàn, với vỏ đèn được gắn vào mặt sau của đèn chiếu sáng. Các núm điều chỉnh thô và tinh tăng hoặc giảm giá đỡ theo từng bước lớn hoặc nhỏ để đưa mẫu vật vào tiêu cự sắc nét. Đèn chiếu sáng thẳng đứng được định hướng theo chiều ngang một góc 90 độ so với trục quang học của kính hiển vi và song song với mặt bàn, với vỏ đèn được gắn vào mặt sau của đèn chiếu sáng. Các núm điều chỉnh thô và tinh tăng hoặc giảm giá đỡ theo từng bước lớn hoặc nhỏ để đưa mẫu vật vào tiêu cự sắc nét.
Giá đỡ kính hiển vi soi ngược kết hợp đèn chiếu sáng dọc trong thân kính hiển vi. Nhiều loại vật kính có thể được sử dụng với kính hiển vi huỳnh quang truyền ánh sáng phản xạ ngược, và tất cả các chế độ chiếu sáng ánh sáng phản xạ đều có thể thực hiện được: trường sáng, trường tối, ánh sáng phân cực, tương phản giao thoa vi phân và huỳnh quang. Một số công cụ bao gồm bộ thay đổi độ phóng đại để phóng to hình ảnh, bộ lọc tương phản và nhiều đường chữ thập. Bởi vì kính hiển vi soi ngược là một công cụ yêu thích của các nhà luyện kim, nên nó thường được gọị là kính hiển vi kim tương. Các nhà sản xuất phần lớn đang chuyển sang sử dụng quang học hiệu chỉnh vô cực trong kính hiển vi huỳnh quang truyền ánh sáng phản xạ, nhưng vẫn có hàng nghìn kính hiển vi chiều dài ống cố định được sử dụng với vật kính được hiệu chỉnh cho chiều dài ống từ 160 đến 210 mm.
Trong đèn chiếu sáng thẳng đứng, ánh sáng truyền từ nguồn sáng, thường là đèn halogen-tungsten 12 vôn 50 hoặc 100 watt, đi qua các thấu kính, qua cửa điều sáng có khẩu độ mở thay đổi. Sau đó, ánh sáng chiếu vào một gương phản xạ thủy tinh phẳng tráng bạc một phần hoặc chiếu vào một phần ngoại vi tráng bạc hoàn toàn để chiếu sáng trường tối. Tấm phản xạ thủy tinh phẳng được mạ bạc một phần ở mặt kính đối diện với nguồn sáng và lớp chống phản xạ được phủ trên mặt kính đối diện với ống quan sát trong trường sáng phản xạ ánh sáng. Do đó, ánh sáng bị lệch hướng xuống vật kính. Các gương nghiêng một góc 45 độ so với đường đi của ánh sáng dọc theo đèn chiếu sáng thẳng đứng.
Trong kính hiển vi huỳnh quang truyền ánh sáng phản xạ, sự hấp thụ và nhiễu xạ của các tia sáng tới của mẫu vật thường dẫn đến các biến thể dễ nhận thấy trong hình ảnh, từ màu đen qua các sắc thái khác nhau của màu xám hoặc màu được nhuộm của mẫu vật. Các mẫu như vậy được gọi là mẫu có biên độ và có thể không yêu cầu các phương pháp hoặc xử lý tương phản đặc biệt để có thể nhìn thấy các chi tiết của chúng. Các mẫu vật khác cho thấy rất ít sự khác biệt về cường độ và/hoặc màu sắc nên các chi tiết đặc trưng của chúng cực kỳ khó nhận biết và phân biệt trong kính hiển vi huỳnh quang truyền ánh sáng phản xạ. Các mẫu thứ hai hoạt động giống như các mẫu pha rất quen thuộc trong công việc ánh sáng truyền qua và phù hợp với các ứng dụng tương phản giao thoa vi sai ánh sáng phản xạ và trường tối.
Kết luận
Chiếu sáng mẫu hiệu quả phụ thuộc rất nhiều vào sự sắp xếp thích hợp của tất cả các thành phần quang học trong kính hiển vi, bao gồm cả nguồn chiếu sáng. Nhà kính hiển vi cần làm quen với phạm vi điều chỉnh của từng thành phần và nên thực hành căn chỉnh chúng với các mẫu và vật kính khác nhau. Ánh sáng không đồng đều có thể ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng của máy chụp ảnh hiển vi và hình ảnh kỹ thuật số, gây ra nhiều hiệu ứng không mong muốn. Một số kính hiển vi mới nhất được trang bị đèn định tâm trước không cho phép điều chỉnh, và một số thậm chí còn cung cấp tụ điện không có cơ chế điều chỉnh bên. Điều quan trọng là đảm bảo rằng các kính hiển vi này được căn chỉnh để chiếu sáng Köhler thích hợp tại nhà máy trước khi tham gia vào quá trình chụp ảnh hiển vi.
Nguồn: https://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/opticaltrain.html
Công ty Minh Khang là nhà phân phối độc quyền thị trường miền Nam phân khúc kính hiển vi hãng Carl ZEISS.
EN