Băng thông của bộ chọn bước sóng (bộ lọc hoặc máy đơn sắc) là một cân nhắc quan trọng đối với các nhà nghiên cứu khi mua máy đọc đĩa vi tấm. Được mô tả là phạm vi bước sóng từ máy đơn sắc mà đĩa vi tấm phát hiện, băng thông ảnh hưởng đáng kể đến độ nhạy và tính tuyến tính của xét nghiệm. Cụ thể hơn, băng thông quang phổ—chiều rộng của băng tần khi ánh sáng ở một nửa giá trị cực đại—xác định lượng ánh sáng có thể đi qua bộ lọc. Băng thông hẹp tương quan với độ phân giải cao, cho phép các nhà nghiên cứu chỉ định và phân biệt các tín hiệu giữa các chất huỳnh quang có bước sóng cực đại rất gần nhau. Ngoài ra, băng thông rộng cải thiện tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu bằng cách cho phép nhiều ánh sáng hơn kích thích mẫu và đến máy dò. Điều này có thể có lợi cho các thí nghiệm có lượng mẫu hạn chế và tín hiệu yếu.
Tại sao điều chỉnh băng thông lại phổ biến
Về cơ bản, các nhà nghiên cứu phải làm việc với một máy đọc đĩa vi tấm cân bằng giữa độ chính xác và độ nhạy. Trong khi một số máy đọc đĩa có bộ đơn sắc băng thông cố định, thì những máy khác cung cấp tùy chọn điều chỉnh băng thông cho phép các nhà nghiên cứu linh hoạt tinh chỉnh cài đặt thiết bị của họ. Với công nghệ này, người dùng có thể điều chỉnh băng thông để đạt được cả độ phân giải cao và độ nhạy cao cho xét nghiệm. Điều này đặc biệt có lợi cho các nhà nghiên cứu cần sự linh hoạt với quy trình làm việc R&D. Ví dụ, điều chỉnh băng thông cho phép ghép kênh sao cho các nhà nghiên cứu có thể đồng thời phát hiện thuốc nhuộm đa kênh hoặc nhiều chất huỳnh quang trong cùng một dung dịch. Nó cũng mang lại lợi thế rõ ràng cho các đỉnh hẹp hoặc chất huỳnh quang dịch chuyển nhỏ để đạt được độ nhạy tối ưu và tăng tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu cho các thí nghiệm. Vì những lý do này, có sự dịch chuyển đáng kể sang băng thông thay đổi cho các ứng dụng cụ thể như truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET), TRF / TR-FRET huỳnh quang phân giải theo thời gian (HTRF) và truyền năng lượng cộng hưởng phát quang sinh học (BRET).
Mặc dù máy đơn sắc điều chỉnh băng thông có vẻ như là tính năng bắt buộc phải có của máy đọc đĩa vi tấm, nhưng điều quan trọng cần lưu ý là nó đi kèm với những thách thức đáng kể. Người dùng chuyển sang điều chỉnh băng thông phải có chuyên môn để xử lý dữ liệu đầu vào, điều chỉnh và hiệu chuẩn của người dùng phù hợp để đảm bảo lựa chọn bước sóng chính xác. Khi sử dụng không đúng cách, băng thông điều chỉnh có thể làm gián đoạn đáng kể các kết quả định lượng và gây nguy hiểm cho kết quả và tính hợp lệ của các xét nghiệm, đặc biệt là đối với các nghiên cứu phát hiện thuốc.
Điều chỉnh băng thông có thể làm giảm tín hiệu, phân tích dữ liệu và thời gian
Đối với các nhà nghiên cứu không nhận thức đầy đủ về mối tương quan giữa băng thông đơn sắc và tín hiệu, việc điều chỉnh băng thông có thể dẫn đến các phép đo không chính xác. Hãy tưởng tượng một bông hoa đỏ tươi trong một cánh đồng đầy những bông hoa rực rỡ. Băng thông hẹp tương tự như việc lấy nét vào bông hoa bằng kính lúp để giảm thiểu sự can thiệp từ các màu khác. Tuy nhiên, việc điều chỉnh tiêu điểm đột ngột – trong khi chụp tất cả các bông hoa khác trong cánh đồng – sẽ làm lu mờ tín hiệu đến từ bông hoa đỏ. Theo cùng một logic, việc điều chỉnh băng thông đơn sắc trong khi chạy cùng một phép thử có thể làm thay đổi kết quả. Để tính đến sự thay đổi này, người dùng nên tối ưu hóa cài đặt thiết bị mỗi lần họ thay đổi băng thông đơn sắc. Nếu không, họ sẽ tiếp tục tạo ra các tín hiệu có độ biến thiên cao từ cùng một phép thử mà không hiểu lý do đằng sau nó. Các tối ưu hóa như vậy tốn thời gian và đầy thách thức nếu bạn không có hướng dẫn và kinh nghiệm phù hợp.
Cùng với những thay đổi về tín hiệu là những thay đổi hạ lưu trong dữ liệu đầu đọc vi tấm, phụ thuộc rất nhiều vào băng thông đơn sắc và chất huỳnh quang cụ thể được sử dụng. Trong khi thay đổi băng thông của thiết bị, người dùng đang thay đổi lượng ánh sáng chiếu tới mẫu hoặc máy dò. Những điều này có tác động trực tiếp đến giới hạn phát hiện và tính tuyến tính của phép thử. Do đó, tín hiệu được phát hiện có thể khác nhau ngay cả đối với các mẫu giống hệt nhau, khiến việc so sánh dữ liệu định lượng giữa các đĩa khác nhau và thậm chí giữa các phép đọc khác nhau của cùng một đĩa trở nên khó khăn. Hơn nữa, khi làm việc với các mẫu có nồng độ thấp, ngay cả khi băng thông giảm nhẹ cũng gây mất độ nhạy và tính tuyến tính, tạo ra các biểu đồ không chính xác. Tương tự như vậy, việc mở rộng băng thông trong quá trình phân tích huỳnh quang có thể khiến thiết bị phát hiện tín hiệu huỳnh quang không mong muốn và làm giảm tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu, do đó làm tăng giới hạn phát hiện.
Tính linh hoạt của điều chỉnh cũng bị lu mờ bởi sự phức tạp của quá trình tối ưu hóa. Đặc biệt, các máy đơn sắc có băng thông được điều chỉnh cung cấp hơn 200 kết hợp kích thích/phát xạ (ex/em) và việc tìm cặp ex/em lý tưởng có thể tốn nhiều thời gian. Các nhà nghiên cứu sử dụng nhiều thuốc nhuộm sẽ cần phải tối ưu hóa cho từng thuốc nhuộm, chưa kể đến việc ngay cả các nồng độ khác nhau của cùng một thuốc nhuộm cũng có thể có các cặp ex/em khác nhau. Nếu thiết bị được nhiều người dùng sử dụng, người ta cũng phải xác minh rằng các thiết lập xét nghiệm ban đầu của họ chưa bị người dùng trước đó sửa đổi. Nhìn chung, các nhà nghiên cứu có thể thấy mình mất hàng giờ chỉ để tối ưu hóa các thiết lập thiết bị. Việc tối ưu hóa không thực tế cuối cùng sẽ hy sinh quá trình định lượng chuẩn hóa, vốn rất quan trọng đối với các quy trình đánh giá và phát triển thuốc.
Xem xét lại các đầu đọc vi tấm đơn sắc băng thông cố định có tùy chọn bộ lọc
Máy đơn sắc băng điều chỉnh có phải là một cuộc cách mạng cho dòng máy đọc đĩa vi tấm không? Điều quan trọng là không bỏ qua tính linh hoạt có được trong các phòng thí nghiệm R&D, nơi tối ưu hóa xét nghiệm là một phần công việc hàng ngày và người dùng hiểu đầy đủ tác động của băng thông điều chỉnh lên dữ liệu của họ. Tuy nhiên, điều quan trọng là phải cân nhắc rằng băng thông điều chỉnh có thể trở thành một phiền toái khi sử dụng không đúng cách và có thể không cần thiết đối với hầu hết các nhà nghiên cứu. Nói như vậy, những giải pháp nào hiện có thể đạt được sự cân bằng giữa độ phân giải và tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu trong khi giảm thiểu các rủi ro đã đề cập?
Máy đọc đĩa vi tấm quang học lai cung cấp tùy chọn lựa chọn giữa băng thông đơn sắc cố định cho các thí nghiệm hàng ngày và các bộ lọc chuyên dụng có băng thông cụ thể để đáp ứng các yêu cầu ứng dụng nhất định. Các hệ thống này thường được thiết lập với một đơn sắc có băng thông trung bình cố định trong phạm vi từ 10 đến 25 nm, cho phép chúng hoạt động liền mạch với hầu hết các chất huỳnh quang cổ điển. Đối với các chất huỳnh quang chuyển dịch dải hấp thu, các nhà nghiên cứu có thể bao phủ dải động bằng cách dịch chuyển bước sóng kích thích và phát xạ đến 85–90% mức tín hiệu tối đa. Đối với các xét nghiệm yêu cầu băng thông rất nhỏ hoặc lớn, các bộ lọc chuyên dụng sẽ đảm bảo rằng các thông số kỹ thuật xét nghiệm có thể được đáp ứng mà không cần thỏa hiệp. Các thiết kế thiết bị này cho phép người dùng sẵn sàng cho tương lai mà không gặp rắc rối về việc tối ưu hóa mạnh mẽ.
Vậy có nên áp dụng điều chỉnh băng thông cho Máy đọc đĩa vi tấm hay không? Và câu trả lời là do người dùng cuối quyết định. Mỗi hệ thống đều có ưu điểm và nhược điểm riêng. Điều quan trọng là phải chọn thiết kế máy đọc đĩa vi tấm đáp ứng được nhu cầu riêng của phòng thí nghiệm và tất cả người dùng đều cảm thấy thoải mái khi nghiên cứu hàng ngày. Chìa khóa để lựa chọn một cách tối ưu là biết ứng dụng nào sẽ chạy trên thiết bị và mức độ linh hoạt mà nghiên cứu đó có thể mang lại.
Tác giả: Caroline Cardonnel
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các Máy đọc đĩa vi tấm hãng Molecular Devices.
EN