Hóa mô miễn dịch (IHC): Tổng quan và Các bước để thực hiện nhuộm IHC chất lượng hơn

IHC được sử dụng trong mô học để phát hiện sự hiện diện của các dấu hiệu protein cụ thể có thể hỗ trợ phân loại và chẩn đoán khối u chính xác. IHC đã phát triển để bổ sung cho các kỹ thuật nhuộm Hematoxylin & Eosin (H&E) và Nhuộm đặc biệt thường cho thấy hình thái mô (cấu trúc). Trong khi H&E và Nhuộm đặc biệt không đặc hiệu, IHC hướng đến một hoặc nhiều dấu hiệu protein cụ thể. IHC được sử dụng như một công cụ chẩn đoán để hỗ trợ chẩn đoán khối u rắn và mẫu tế bào học và đã được sử dụng như một công cụ chẩn đoán chính thống trong gần nửa thế kỷ.

Kháng nguyên mục tiêu

Kháng nguyên là protein nằm bên trong hoặc trên bề mặt tế bào. Các nhà nghiên cứu bệnh học tìm kiếm sự hiện diện hoặc vắng mặt của các kháng nguyên cụ thể để hỗ trợ chẩn đoán.

Có hàng trăm kháng nguyên được phát hiện có ích cho chẩn đoán. Thông thường, một nhà nghiên cứu bệnh học sẽ sử dụng một “bảng” gồm nhiều kháng nguyên để giúp phân loại đầy đủ một khối u cụ thể.

Kháng thể chính

Giai đoạn đầu tiên của IHC là sử dụng kháng thể chính có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên mục tiêu.

Có hai loại kháng thể chính, đa dòng và đơn dòng. Kháng thể đa dòng có ái lực với và liên kết với nhiều epitope (hoặc các phần) hoặc kháng nguyên đích, và do đó dễ phản ứng chéo với các kháng nguyên không phải đích hơn.

Kháng thể đơn dòng chỉ có ái lực với một epitope và có xu hướng tạo ra nhuộm màu đặc hiệu hơn nhưng ít nhạy hoặc ít mạnh hơn.

Kháng thể thứ cấp

Tiếp theo, kháng thể thứ cấp liên kết với kháng thể chính. Đây được gọi là IHC gián tiếp. Hiện nay, nó thường được sử dụng vì nhiều kháng thể thứ cấp có thể liên kết với một kháng thể chính duy nhất để khuếch đại cường độ nhuộm.

Hệ thống phát hiện được xây dựng dựa trên thứ cấp. Phát hiện sắc tố hiện đại sử dụng các enzyme như Horseradish Peroxidase (HRP) được liên hợp (kết hợp) với kháng thể. Nhiều enzyme gắn vào kháng thể được gọi là polyme và chúng lại tạo ra sự nhuộm màu mạnh hơn vì có nhiều phân tử hơn để sắc tố bám vào.

Chất tạo màu

Cuối cùng, một chất nền tạo thành một chất kết tủa màu không hòa tan có thể được quan sát dưới kính hiển vi. Có hai chất tạo màu thường được sử dụng: DAB (nâu) hoặc AP (đỏ).

DAB được sử dụng cho hầu hết các ứng dụng vì nó cung cấp nhuộm màu mạnh và lâu dài. AP Red (hoặc một chất tạo màu đỏ khác) chủ yếu được sử dụng cho các phần da mà DAB màu nâu có thể bị che khuất bởi sắc tố melanin màu nâu.

Cả DAB và AP Red đôi khi được sử dụng trong cùng một phần mô để cho phép nhà nghiên cứu bệnh học hình dung hai kháng nguyên trong một slide. Đây là một quá trình được gọi là nhuộm kép.

Nhuộm IHC hoàn chỉnh

Đây là vết nhuộm IHC điển hình, trong đó chất kết tủa màu nâu chỉ ra sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu – trong trường hợp này là Cytokeratin 5 trên sinh thiết tuyến tiền liệt. Lượng nhuộm, kiểu nhuộm và vị trí nhuộm (nhân tế bào chất hoặc màng) đều cung cấp thông tin cho nhà bệnh học chẩn đoán.

Nền xanh là thuốc nhuộm đối kháng hematoxylin thường được áp dụng sau chất tạo màu. Thuốc nhuộm đối kháng cung cấp độ tương phản với chất tạo màu và cũng giúp nhà nghiên cứu bệnh học hình dung cấu trúc mô bên dưới.

Bước 2 – Đảm bảo cố định tối ưu

Việc cố định chất lượng tốt bằng cách sử dụng các điều kiện cố định đã biết và nhất quán (loại chất cố định, độ pH, nhiệt độ, thời gian) sẽ mang lại kết quả tốt nhất. Các mẫu vật nên được kiểm tra trước khi xử lý để xác định xem có cần cố định thêm hay không.

Điều kiện cố định không nhất quán, tạo ra các mô cố định không đủ hoặc cố định quá mức, dẫn đến kết quả khác nhau và gây khó khăn cho việc khắc phục sự cố.

Bước 4 – Tránh sự chênh lệch nồng độ

Có thể tránh được sự chênh lệch nồng độ bằng cách sử dụng thuốc thử một cách cẩn thận.

“Đôi khi chúng tôi thấy vết nhuộm đậm ở một đầu của phiến kính chuyển sang vết nhuộm nhạt ở đầu kia.”

Bước 5 – Chọn kháng thể cẩn thận

Hãy lựa chọn kháng thể chính một cách cẩn thận liên quan đến độ nhạy và độ đặc hiệu của nó. Lưu ý rằng các kháng thể do các nhà cung cấp khác nhau bán thường có nguồn gốc từ cùng một nguồn và được gắn nhãn để bán. Điều quan trọng là phải sử dụng tên bản sao khi đánh giá kháng thể.

“Chúng tôi mua kháng thể chỉ dựa trên giá cả.”

Bước 6 – Đọc bảng thông số kỹ thuật

Biết được kháng thể chính. Luôn kiểm tra bảng thông số kỹ thuật để xác định tính phù hợp của phương pháp đối với một kháng thể cụ thể. Bảng thông số kỹ thuật nên được cập nhật khi mua một lô kháng thể mới.

“Chúng tôi không có quyền truy cập vào các bảng thông số kỹ thuật kháng thể trong phòng thí nghiệm của mình.”

Bước 7 – Tối ưu hóa phương pháp truy xuất

Chọn điều kiện tách lớp thích hợp cho kháng thể chính được sử dụng, mô được nhuộm và phương pháp cố định được sử dụng (pH, thuốc thử, điều kiện phản ứng).

Kỹ thuật truy xuất tương tự được sử dụng cho tất cả các dữ liệu chính với giả định rằng có một phương pháp HIER phổ quát thành công.

Bước 8 – Xem xét phản ứng chéo của kháng thể

Hãy lưu ý đến bất kỳ vấn đề tiềm ẩn nào liên quan đến phản ứng chéo của kháng thể (đọc thông số kỹ thuật).

Không có nỗ lực nào được đưa ra để giải thích hiện tượng nhuộm màu dương tính bất ngờ.

Bước 9 – Ngăn chặn hoạt động của enzyme peroxidase có trong mô

Đối với hệ thống phát hiện dựa trên peroxidase, luôn sử dụng bước chặn peroxidase.

Nhuộm không đặc hiệu thường thấy ở hồng cầu, bạch cầu hạt, bạch cầu đơn nhân và ở cơ. Điều này là do peroxidase có trong mô không được chặn hoàn toàn.

Bước 11 – Sử dụng hệ thống phát hiện thích hợp

Chọn hệ thống phát hiện phù hợp có khả năng nhuộm màu chính xác, cụ thể với độ nhạy đủ.

“Chúng tôi đã sử dụng cùng một hệ thống phát hiện trong một thời gian dài và không thấy lý do gì để thay đổi. Đôi khi nhuộm màu yếu và không sắc nét như mong đợi.”

Bước 12 – Chuẩn hóa các bước rửa

Sử dụng các bước rửa chuẩn hóa trong suốt quá trình (thời gian, thể tích và hình thức khuấy). Điều này sẽ đảm bảo tính nhất quán của kết quả.

Kết quả rất khác nhau trong các lần chạy với cùng một kháng thể và giữa các lần chạy vào những ngày khác nhau. Điều này có thể là do các kỹ thuật rửa khác nhau được sử dụng bởi các kỹ thuật viên khác nhau.

Bước 13 – Tối ưu hóa nhuộm màu đối lập

Mức độ nhuộm đối lập hạt nhân được điều chỉnh và chuẩn hóa cẩn thận để không làm mờ nhuộm dương tính. Nhuộm đối lập phải cung cấp độ tương phản tốt nhất có thể giữa chất tạo màu và các thành phần mô nền. Một chất nhuộm đối lập thích hợp được chọn cho chất tạo màu được sử dụng.

Phản ứng nhuộm hạt nhân đôi khi rất mạnh. Điều này có thể che khuất nhuộm đặc hiệu yếu.

Bước 14 – Kiểm soát phù hợp

Luôn sử dụng các biện pháp kiểm soát dương tính và âm tính thích hợp được kiểm tra cẩn thận để xác nhận kết quả. Các biện pháp kiểm soát dương tính và âm tính nội bộ cũng quan trọng và cung cấp một phương tiện tối ưu để đảm bảo chất lượng trong IHC

“Chúng tôi chỉ thực hiện kiểm tra khi phương pháp có vẻ không hiệu quả”