Giới thiệu
Trong ghi chú ứng dụng này, Máy phân tích khả năng sống của tế bào Vi-CELL BLU và máy phân tích Roche Cedex® HiRes đã được thử nghiệm về hiệu suất đếm với các tế bào CHO và HEK trên một phạm vi đo rộng. Cả hai thiết bị đều cho thấy hiệu suất đếm tối ưu với một số điều chỉnh đối với cài đặt loại tế bào tiêu chuẩn – đã thu được kết quả tương đương. Vi-CELL BLU đã cho thấy một số lợi thế về thông lượng, phạm vi, thời gian đo và thể tích mẫu. Ngoài ra, Vi-CELL BLU cho phép thay đổi số lượng chu kỳ pha loãng và hút, có thể cải thiện hiệu suất khi làm việc với các dòng tế bào cụm
Phương pháp
Trước khi đo bằng dung dịch tế bào, các tiêu chuẩn hiệu chuẩn đã được sử dụng để xác nhận cả hai thiết bị đều được thiết lập đúng cách và hoạt động trong phạm vi thông số kỹ thuật. Các tiêu chuẩn được liệt kê trong Bảng 1 đã được thử nghiệm theo bốn bản sao, theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
| Thiết bị | Tiêu chuẩn kiểm soát | Nhiều | Giá trị mong đợi |
|---|---|---|---|
| Máy phân tích khả năng sống của tế bào Vi-CELL BLU | Nồng độ 0,5 M | 148 | 0,498 *10 6 /mL ± 10% |
| Nồng độ 10 M | 168 | 9,9 *10 6 /mL ± 10% | |
| khả năng sống 50% | 162 | 48,7% ± 10% | |
| Máy phân tích Roche Cedex® HiRes | Hạt kiểm soát 5*10 5 | – | 0,5*10 6 /mL ± 10% |
| Hạt kiểm soát 1*10 6 | – | 1*10 6 /mL ± 10% | |
| Hạt kiểm soát 5*10 6 | – | 5*10 6 /mL ± 10% | |
| Hạt khả thi 60% | – | 60% ± 10% |
Bảng 1. Tiêu chuẩn kiểm soát được sử dụng trên hai thiết bị đếm tế bào
Sau đó, các chuỗi pha loãng với tế bào FreeStyle CHO-S (Thermo Fisher) và FreeStyle 293-F (Thermo Fisher) đã được thực hiện và đo trên cả hai thiết bị để kiểm tra độ chính xác và tính tuyến tính trên một phạm vi nồng độ rộng. Cả hai dòng tế bào đều được nuôi cấy trong bốn ngày ở 37°C, 250 vòng/phút ở 5% CO2 trong môi trường FreeStyle CHO hoặc 293 Expression. Sau đó, các tế bào được thu hoạch và mật độ tế bào được xác định trước khi tạo viên tế bào ở 180 rcf trong 5 phút. Phần dịch nổi được loại bỏ và các tế bào được huyền phù lại trong môi trường mới và các bước pha loãng sau đây (Bảng 2) được thực hiện. Nồng độ tối đa của máy phân tích Roche Cedex® HiRes (10*10 6 tế bào/mL) được mô tả là pha loãng 100%, để phản ánh đây là phạm vi trên mà người ta mong đợi có được kết quả chính xác và có thể so sánh được.
| Hệ số pha loãng [%] | Target TCD [*10 6 tế bào/mL] | CHO-S | HEK 293-F |
|---|---|---|---|
| 150 | 15 | x | |
| 100 | 10 | x | x |
| 50 | 5 | x | x |
| 25 | 2,5 | x | |
| 20 | 2 | x | |
| 10 | 1 | x | |
| 5 | 0,5 | x | |
| 2,5 | 0,25 | x |
Bảng 2. Các hệ số pha loãng với dòng tế bào CHO-S và HEK 293-F
Tất cả các huyền phù tế bào đều được đo theo bốn bản sao trên thiết bị Vi-CELL BLU sử dụng đĩa mẫu 96 giếng và – do hạn chế về dung lượng – theo ba bản sao trên máy phân tích Roche Cedex® HiRes. Để tránh các tác động từ quá trình lắng đọng và sự phát triển của tế bào trong môi trường mới, huyền phù tế bào được nạp vào máy phân tích Roche Cedex® HiRes ngay sau khi chuẩn bị chuỗi pha loãng. Các mẫu được sắp xếp sao cho toàn bộ chuỗi được đo trước khi tiến hành các phép đo lặp lại sao cho bất kỳ tác động tiềm ẩn nào – như lắng đọng – do thời gian chờ dài hơn trên sàn mẫu đều được giảm thiểu.
Kết quả
Các phép đo với hạt kiểm soát nồng độ nằm trong phạm vi giá trị mong đợi và cho thấy tính tuyến tính tối ưu. Đường trendline phải đi qua (0,0) để mô phỏng phép đo trống.
Vi-CELL BLU concentration protocol
Alternative cell counter concentration protocol
Hình 1. Kết quả kiểm soát nồng độ của hai thiết bị
Tiêu chuẩn kiểm soát khả năng sống của thiết bị Vi-CELL BLU dẫn đến khả năng sống trung bình được đo là 46,4% ở giá trị mong đợi là 48,7% và đối với máy phân tích Roche Cedex® HiRes, khả năng sống 63% được đo ở mức mong đợi là 60%; nghĩa là cả hai thiết bị đều thực hiện trong các thông số kỹ thuật (xem bảng 1 để biết thông số kỹ thuật). Bây giờ, các chuỗi pha loãng CHO đã được đo trên cả hai thiết bị. Trên máy phân tích khả năng sống của tế bào Vi-CELL BLU, các phép đo được thực hiện theo bốn bản sao bằng cách sử dụng Normal Wash (thể tích mẫu 200 μL). Vi-CELL BLU được sử dụng cho các thí nghiệm này đã có một loại tế bào được thiết kế riêng để đo tế bào CHO và loại tế bào được tối ưu hóa này đã được sử dụng cho các phép đo này (Hình 2) .
Hình 2. Các thông số loại tế bào CHO tùy chỉnh trên Vi-CELL BLU
Trên máy phân tích Roche Cedex® HiRes, các mẫu được chạy theo bộ ba sử dụng các thiết lập mặc định, với 300 μL thể tích mẫu. Máy phân tích khả năng sống của tế bào Vi-CELL BLU đo 20 mẫu trong khoảng 35 phút, máy phân tích Roche Cedex® HiRes cần khoảng 60 phút cho 15 mẫu. Mật độ tế bào sống và tổng thể trung bình được tính theo mỗi lần pha loãng và được biểu diễn theo hệ số pha loãng để xác định tính tuyến tính của các thiết bị trên phạm vi đo lường của chúng (Hình 3) .
Chuỗi pha loãng với tế bào CHO
Hình 3. Chuỗi pha loãng CHO được đo trên 2 thiết bị đếm tế bào
Như được thấy trong Hình 3, cả hai thiết bị đều cho thấy tính tuyến tính tối ưu trên toàn bộ phạm vi được thử nghiệm với giá trị R2 > 0,999. Máy phân tích khả năng sống của tế bào Vi-CELL BLU báo cáo mật độ tế bào cao hơn một chút cho tất cả các bước pha loãng, nhưng có thể dự đoán một số sự khác biệt vì cài đặt loại tế bào mặc định trên máy phân tích Roche Cedex® HiRes không được tối ưu hóa.
Sau đó, chuỗi pha loãng HEK được đo. Vì các dòng tế bào huyền phù HEK được biết là dễ bị liên kết thành cụm, nên loại tế bào Động vật có vú mặc định của thiết bị Vi-CELL BLU đã được chỉnh sửa: các chu kỳ hút và pha loãng bổ sung đã được đưa vào (Hình 4) . Máy phân tích Roche Cedex® HiRes không cho phép các bước hút và pha loãng bổ sung, vì vậy các cài đặt loại tế bào mặc định đã được sử dụng.
Hình 4. Các thông số loại tế bào động vật có vú cài đặt riêng trên Vi-CELL BLU
Vi-CELL BLU đã đo được 24 mẫu chỉ trong vòng chưa đầy 55 phút, sử dụng chế độ làm sạch thông thường. Trên máy phân tích Roche Cedex® HiRes, có thể nạp tối đa 20 mẫu cùng một lúc. Do đó, chuỗi pha loãng được đo theo bộ ba thay vì bộ bốn và 18 mẫu thu được được đo trong khoảng 1,5 giờ. Một lần nữa, 200 và 300 μL dung dịch huyền phù tế bào được sử dụng trên máy đếm tế bào Vi-CELL BLU và máy phân tích Roche Cedex® HiRes.
Chuỗi pha loãng với tế bào HEK
Hình 5. Chuỗi pha loãng HEK được đo trên hai thiết bị
Giá trị TCD trung bình trong Hình 5 cho thấy tính tuyến tính tối ưu (R2 > 0,999) cho cả hai thiết bị trong phạm vi đo lường tương ứng của chúng. Tuy nhiên, mật độ tế bào tổng thể đo được cao hơn đáng kể trong máy phân tích khả năng sống của tế bào Vi-CELL BLU. Độ liên kết của các tế bào HEK đã được xác nhận bởi các giá trị đếm cụm của thiết bị Vi CELL BLU, với ví dụ, trung bình là 50,5 cụm cho các mẫu pha loãng 50%. Máy phân tích Roche Cedex® HiRes cũng báo cáo các tế bào kết tụ trên tất cả các pha loãng.
Các tế bào liên kết thành cụm khó đếm hơn và kết quả đếm tế bào với các nuôi cấy liên kết có thể đánh giá thấp nồng độ tế bào (ISO 20391, 1). Do đó, hầu hết các máy phân tích tế bào cho phép người dùng tự xác định các thông số đếm tế bào (đã tối ưu hóa). Ví dụ, trên máy phân tích khả năng sống của tế bào Vi-CELL BLU, mức độ Decluster ảnh hưởng đến cách đếm các cụm tế bào. Trong Hình 6, hiệu ứng của các cài đặt mức độ Decluster khác nhau được thể hiện bằng cách so sánh hình ảnh từ một trong các mẫu pha loãng 50% trên thiết bị Vi-CELL BLU. Rõ ràng, phân tích với mức độ Decluster cao dẫn đến việc đếm thêm các tế bào.
Hình 6. Phân tích hình ảnh trên Vi CELL BLU với mức độ Decluster (tùy chỉnh tiêu chuẩn: Trái, Cao: Phải)
Để chứng minh hiệu ứng của việc tối ưu hóa loại tế bào trên cả hai thiết bị, kết quả từ Hình 5 đã được phân tích lại với các thông số đã thay đổi. Máy phân tích Roche Cedex® HiRes không cho phép bất kỳ thay đổi nào trong quá trình trộn và pha loãng, nhưng nó cho phép tăng khả năng nhận diện cả tế bào sống và tế bào chết và để tối ưu hóa quá trình phân tích các cụm tế bào. Các thông số tương ứng đã được thiết lập để có được nồng độ tế bào sống và tổng thể tối đa. Tương tự như vậy, các mẫu trên máy phân tích khả năng sống của tế bào Vi-CELL BLU đã được phân tích lại với mức độ Decluster được thiết lập thành High. Các thông số khác trên máy đếm tế bào Vi-CELL BLU không thay đổi.
Chuỗi pha loãng với các thông số đếm được tối ưu hóa cho tế bào HEK
Hình 7. Chuỗi pha loãng tế bào HEK với các thông số đếm được điều chỉnh trên hai thiết bị
Kết quả phân tích lại trong Hình 7 vẫn cho thấy tính tuyến tính tối ưu, nhưng với nồng độ tế bào tăng lên đối với cả hai thiết bị. Cần phải nghiên cứu thêm để tìm ra cài đặt tối ưu để đếm các tế bào HEK này. Tuy nhiên, máy phân tích Vi-CELL BLU có thể đếm được nhiều tế bào hơn so với máy phân tích Roche Cedex® HiRes, ngay cả khi các thông số đếm có liên quan của máy phân tích kia được đặt ở mức tối đa. Trên thực tế, lần chạy ban đầu với cài đặt mức độ Medium Decluster dẫn đến số lượng đếm rất tương đương so với cài đặt tối ưu trên thiết bị đếm tế bào kia. Ở đây, các chu kỳ hút và trộn tăng lên trên thiết bị Vi-CELL BLU có thể đã giúp phá vỡ một số liên kết cụm có trong mẫu, dẫn đến tăng khả năng nhận diện tế bào. Ngoài ra, để tối ưu hóa thêm trên máy phân tích Vi-CELL BLU, một số thông số khác như Độ sắc nét của tế bào, Độ tròn tối thiểu hoặc Độ sáng điểm khả thi có thể được nghiên cứu.
Kết luận
Cả hai thiết bị đều cho thấy tính tuyến tính tối ưu khi đo cả dòng tế bào CHO và HEK. Các thông số đếm tế bào ban đầu được sử dụng dẫn đến số lượng cao hơn trên máy phân tích khả năng sống của tế bào Vi-CELL BLU. Hơn nữa, cả hai thiết bị đều cho phép tăng nồng độ tế bào được đo bằng cách thay đổi các thông số loại tế bào được sử dụng để phân tích hình ảnh. Tuy nhiên, giới hạn trên của thiết bị đếm tế bào thay thế thấp hơn nhiều so với số lượng quan sát được trên Vi-CELL BLU sau khi đặt mức độ Decluster thành High .
Máy phân tích khả năng sống của tế bào Vi-CELL BLU cho phép tối ưu hóa lượng chu kỳ trộn và pha loãng, có thể giúp đếm chính xác các dòng tế bào cụm. Hơn nữa, thiết bị Vi-CELL BLU có thông lượng cao hơn tương đối ở thời gian đo thấp hơn trong khi sử dụng thể tích mẫu thấp hơn.
Tài liệu tham khảo
1. ISO 20391-1:2018. Tổ chức Tiêu chuẩn hóa Quốc tế. sl: ISO/TC 276 Công nghệ sinh học, 2018-01.
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp thiết bị phân tích khả năng sống của tế bào hãng Beckman Coulter.
EN