Tìm hiểu khoa học xử lý mô: Khái niệm, Quy trình và Công nghệ

Vì cồn và parafin không thể trộn lẫn, một dung môi trung gian hoàn toàn có thể trộn lẫn với cả hai (như xylene) phải được sử dụng.

• Dung môi này thay thế cồn trong mô thông qua quá trình gọi là “làm trong”.
• “Làm trong” liên quan đến cách các chất làm trong tạo ra sự trong suốt hoặc quang minh cho mô do chỉ số khúc xạ tương đối cao của chúng.
• Một vai trò quan trọng khác của chất làm trong là loại bỏ một lượng đáng kể chất béo từ mô, chất này nếu không sẽ tạo ra một rào cản đối với sự thâm nhập của parafin.
• Để đảm bảo rằng tất cả các dấu vết của cồn được loại bỏ khỏi các mô đang được xử lý, cần thay đổi nhiều lần dung môi mới, rõ ràng không có cồn còn sót lại.

Bước 3: Thẩm thấu

Mẫu vật hiện có thể được thẩm thấu bằng parafin. Parafin nóng chảy thấm vào mô và khi nguội sẽ đông đặc lại, có độ cứng cho phép cắt trên máy cắt vi thể.

• Lượng hỗ trợ cấu trúc do parafin đông đặc cung cấp có thể được điều chỉnh bằng cách chọn các công thức parafin khác nhau.
• Cần thay đổi nhiều lần parafin trong quá trình mô học để hoàn toàn thay thế chất làm trong.
• Sự thẩm thấu của parafin được tăng cường đáng kể bằng cách hút chân không.

Các phương pháp xử lý mô

Xử lý thủ công

• Đây là phương pháp chậm và tốn nhiều công sức nhất vì việc chuyển mẫu hoặc thay đổi thuốc thử được thực hiện bằng tay. Với sự phát triển của tự động hóa, phương pháp này hầu như đã lỗi thời.

Xử lý tự động

• Bộ chuyển mẫu hoặc máy “nhúng và nhúng”: Các thiết bị này chuyển các hộp đựng từ trạm này sang trạm khác theo cấu hình quay hoặc tuyến tính.
• Các thiết bị chuyển chất lỏng hoặc thiết bị “đóng kín” giữ các mẫu vật trong một buồng xử lý hoặc nồi hơi và các thuốc thử được bơm vào và ra trong quá trình xử lý.
• Xử lý hỗ trợ bằng lò vi sóng: Có thể yêu cầu chuyển mẫu hoặc thuốc thử thủ công, giúp tăng tốc quá trình xử lý bằng cách làm nóng thuốc thử.

Các bước chuẩn bị cho quá trình xử lý tối ưu

Cố định mô

Cố định mô là một bước quan trọng trong việc chuẩn bị các mẫu cắt mô học. Nếu không được thực hiện trong điều kiện tối ưu hoặc nếu việc cố định bị trì hoãn, mẫu mô có thể bị hư hại không thể phục hồi, làm ảnh hưởng đến thông tin hình thái và hóa mô.

• Thời gian cố định tối ưu sẽ khác nhau giữa các loại chất cố định, loại mô và kích thước mô. Mô đặc hoặc có nhiều chất béo thường cần nhiều thời gian hơn để được cố định hoàn toàn.
• Chất cố định thường được sử dụng nhất là formalin đệm trung tính. Nó có thể được tích hợp vào lịch trình xử lý trên các máy xử lý mô dạng kín.

Formalin là chất cố định phổ biến nhất được sử dụng trong mô bệnh học. Nó cố định mô bằng cách làm bất động protein, tạo ra một ma trận rộng lớn của các liên kết chéo.

Khử canxi

Xương và các mẫu vật đã bị vôi hóa khác phải được khử vôi trước khi xử lý và thẩm thấu parafin.

• Khi khoáng chất đã được loại bỏ, có thể sử dụng lịch trình xử lý tiêu chuẩn.
• Phần lớn chất khử vôi axit nên được rửa sạch trước khi xử lý để tránh làm nhiễm bẩn các thuốc thử xử lý.
• Mặc dù đã khử vôi hoàn toàn, xương (đặc biệt là xương đặc) sẽ chứa các khu vực dày đặc cần được xử lý kỹ lưỡng. Trong trường hợp này, nên chọn lịch trình xử lý lâu hơn.

Phẫu tích

Để cố định tối ưu và xử lý chất lượng cao, kích thước của mẫu mô rất quan trọng. Độ dày lý tưởng không nên vượt quá 4mm và mẫu phải vừa vặn trong hộp mô học mà không bị biến dạng.

• Có thể “xử lý quá mức” một mẫu nhỏ và mỏng manh hoặc “xử lý thiếu” các mẫu lớn, đặc, khiến chúng rất khó, nếu không muốn nói là không thể cắt trên máy cắt vi thể.
• Thời gian xử lý cũng khác nhau đối với các loại mô khác nhau: một số mô được thẩm thấu bởi các thuốc thử tương đối dễ dàng (thận, phổi) trong khi những mô khác có khả năng chống chịu cao hơn nhiều (cổ tử cung, cơ) và cần nhiều thời gian hơn, tức là, lịch trình khác nhau.

Bảo vệ mẫu vật

Các hộp mô (cassettes) giữ và bảo vệ mẫu vật trong quá trình xử lý.

• Các hộp mô chọn phải hoàn toàn kháng lại các dung môi và nhiệt độ sử dụng trong quá trình xử lý. Chúng không được biến dạng trong khi sử dụng để tránh việc mẫu vật có thể thoát ra vào các thuốc thử xử lý.
• Bề mặt của hộp mô phải được perforated (có lỗ) để cho phép trao đổi chất lỏng đầy đủ và thoát nước đúng cách.
• Các mẫu nhỏ có thể được bảo vệ bằng cách bọc chúng trong giấy không có xơ, đặt vào túi sinh thiết lưới mịn hoặc “kẹp” bằng các miếng đệm sinh thiết.

Chất cố định

• Trong tình huống lý tưởng, mỗi mẫu vật sẽ được cố định hoàn toàn trước khi bắt đầu xử lý.
• Các mẫu nhỏ không yêu cầu thời gian cố định dài thường được cố định hoàn toàn trên máy xử lý (“cố định trực tuyến”).
• Hầu hết các phòng thí nghiệm sẽ bao gồm chất cố định như là bước đầu tiên trong máy xử lý của họ để cung cấp thêm thời gian trong chất cố định trước khi tiếp tục với quá trình khử nước.

Chất khử nước

• Hầu hết các chất làm khô là rượu (ví dụ: ethanol, methanol, isopropanol, butanol).
• Ethanol, là chất làm khô được sử dụng rộng rãi nhất, là một loại rượu uống và do đó bị kiểm soát nghiêm ngặt (cần giấy phép và lưu giữ hồ sơ) bởi hầu hết các chính phủ. Để giảm bớt sự phiền phức, các nhà sản xuất thêm methanol và/hoặc isopropanol để làm cho nó không phù hợp để tiêu thụ. Sản phẩm như vậy được gọi là rượu hóa chất hoặc rượu đã bị biến tính và không bị kiểm soát.
• Quá trình làm khô thường bắt đầu với rượu 70%, sau đó là vài lần thay đổi các loại rượu với nồng độ tăng dần, thường là 80%, 95% và 100% rượu.
• Khuấy trộn cơ học làm tăng tốc độ mà cồn thay thế nước trong quá trình làm khô.
• Các máy xử lý mô cho phép áp dụng nhiệt nhẹ trong quá trình làm khô. Vì việc làm ấm các chất lỏng làm giảm độ nhớt của chúng, điều này làm tăng hiệu quả của quá trình làm khô bằng cách tăng khả năng thẩm thấu vào mô.
• Làm khô lâu dài và chậm mang lại kết quả chất lượng tốt nhất. Xử lý qua đêm là phổ biến nhất, với nhiều phòng thí nghiệm sử dụng xử lý cùng ngày cho các mẫu sinh thiết nhỏ.
• Quá trình làm khô, khi thực hiện ở nhiệt độ phòng, bắt đầu với nồng độ cồn vừa phải, gây ra sự co rút nhẹ của mô.

Chất làm sạch

Quá trình làm trong (clearing) ban đầu được gọi như vậy vì các thuốc thử sử dụng cho bước này có chỉ số khúc xạ cao và sẽ làm cho mô trở nên trong suốt.

• Các chất làm trong là dung môi hoàn toàn hòa tan với cả cồn và parafin. Chúng thay thế cồn trong mô, sau đó cồn sẽ được thay thế bởi parafin nóng chảy trong bước tiếp theo.
• Thời gian dài trong nhiều chất làm trong có thể làm cho mô trở nên cứng và dễ gãy, trong khi làm trong không đầy đủ sẽ làm cho việc cắt mô trở nên cực kỳ khó khăn.
• Vì mức độ dung nạp của parafin đối với chất làm trong cao hơn so với nước, nên số lần thay đổi cần ít hơn so với quá trình làm khô. Tối thiểu nên sử dụng hai lần thay đổi, nhưng ba hoặc bốn lần thay đổi là được khuyến nghị.
• Giống như trong quá trình làm khô, khuấy trộn nhẹ có thể cải thiện quá trình làm trong và giảm thời gian cần thiết để hoàn thành
• Thời gian làm trong thay đổi tùy thuộc vào chất làm trong cụ thể được sử dụng. Các hợp chất thơm (xylene, toluene, benzene) có khả năng dung nạp nước cao hơn so với các hợp chất aliphatic (thay thế xylene, limonene), do đó yêu cầu ít lần thay đổi và ít thời gian hơn để thay thế cồn.

Lựa chọn thuốc thử làm sạch

Xylene

Xylenne: Là một hợp chất thơm, xylene có lẽ là chất làm trong phổ biến nhất dù nhiều phòng thí nghiệm đang tìm cách sử dụng các chất thay thế ít độc hơn. Nó thay thế cồn nhanh chóng khỏi mô và, do chính nó là một dung môi parafin tuyệt vời, có thể được thay thế khỏi mô một cách tương đối dễ dàng bởi parafin nóng chảy.

Các chất thay thế xylene

Các dung môi dựa trên alkane và limonene đã trở nên phổ biến để sử dụng làm chất làm trong. Chúng có độc tính thấp hơn xylene và bao gồm các hỗn hợp hydrocarbon aliphatic. Tuy nhiên, các thuốc thử này có khả năng dung nạp nước kém và các lịch trình xử lý cần phải được kéo dài.

Paraffins

• Parafin khi được làm nóng đến khoảng 60°C trở thành dạng lỏng và có thể thẩm thấu vào mô. Sau vài bước thẩm thấu, nó được để nguội đến nhiệt độ phòng, nơi nó đông đặc lại với độ cứng phù hợp để cắt.
• Vì parafin đông đặc giữ các tế bào và cấu trúc giữa tế bào trong mối quan hệ đúng đắn của chúng, nó còn được gọi là môi trường hỗ trợ.
• Parafin là hỗn hợp của sáp tinh chế và các phụ gia khác, có thể bao gồm nhựa plastic (polymers), chất chống oxy hóa, phẩm nhuộm và các phụ gia khác
• Các mô lớn, mỡ hoặc đặc cần được xử lý bằng chu trình dài hơn so với các mẫu nhỏ và mỏng manh.
• Sự thẩm thấu của parafin được hỗ trợ rất nhiều bởi chân không; tuy nhiên, chân không và nhiệt nên được áp dụng cẩn thận khi xử lý các mẫu rất nhỏ.
• Khi sử dụng các máy xử lý mô dạng kín hiện đại, nên thay đổi ít nhất ba lần parafin để đảm bảo tất cả các dấu vết của chất làm trong được loại bỏ khỏi các mô đang được xử lý.

Xử lý không chứa xylene

Vì xylene là một dung môi tương đối nguy hiểm, các phòng thí nghiệm đang bị áp lực phải tìm kiếm các lựa chọn ít độc hơn cho việc sử dụng thường xuyên.

• Một phương pháp không chứa xylene đã được phát triển, không chỉ loại bỏ xylene trong bước xử lý mà còn trong các bước loại bỏ parafin trong quá trình nhuộm thông thường.

Quy trình gia nhiệt

• Trong thập kỷ qua, việc xử lý mô bằng lò vi sóng đã được giới thiệu vào các phòng thí nghiệm mô học.
• Thời gian xử lý được giảm đáng kể, nhưng số lượng mẫu xử lý vẫn rất thấp.
• Chỉ nên sử dụng lò vi sóng dành cho phòng thí nghiệm vì nhiệt độ phải được kiểm soát cẩn thận và lò vi sóng phải được thông gió giống như một tủ hút hóa chất.
• Công nghệ này đặc biệt hữu ích cho các mẫu sinh thiết kích thước nhỏ.
• Các thuốc thử sử dụng trong xử lý bằng lò vi sóng bao gồm ethanol, isopropanol và parafin.

Nguồn: https://www.leicabiosystems.com/knowledge-pathway/science-of-tissue-processing/

Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp Thiết bị xử lý mô đến từ hãng Leica Biosystems.