Tổng quan
Các mục tiêu về epigenetic (di truyền học biểu sinh) tiếp tục mang đến những cơ hội hấp dẫn cho những nỗ lực khám phá thuốc trong ngành dược phẩm. Những hoạt động như vậy thường liên quan đến việc phân tích một số epigenetic enzyme biểu sinh và sàng lọc các chất ức chế các mục tiêu này có thể góp phần vào việc tiêu thụ nhanh chóng các thư viện phức hợp trong các chiến dịch có hiệu suất cao. Công nghệ Thao tác chất lỏng bằng sóng âm của hệ thống Echo 555 cho phép phân phối khối lượng hợp chất nanolit và đã trở thành tiêu chuẩn cho việc khám phá thuốc. Nỗ lực sàng lọc được mô tả trong ghi chú ứng dụng này đã sử dụng khả năng kích thước giọt 2,5 nL của Bộ thao chất lỏng Echo 555 để phân phối các hợp chất và khả năng kích thước nhỏ giọt 25 nL lớn hơn của Echo 525 tích hợp để truyền thuốc thử epigenetic dạng nước trong xét nghiệm sàng lọc tự động bằng cách sử dụng Trạm máy phòng thí nghiệm Access.
Giới thiệu
Epigenetic được xem là mục tiêu quan trọng để khám phá thuốc và nghiên cứu ung thư. Histone Deacetylase 1 (HDAC1) là một epigenetic enzyme điều hòa quá trình phiên mã gen bằng cách loại bỏ các nhóm acetyl khỏi dư lượng lysine trên histone và gây ra sự ngưng tụ chất nhiễm sắc. Các bệnh ung thư ở hệ thống dạ dày, tuyến tiền liệt, ruột kết và vú ở người đã chứng minh sự gia tăng biểu hiện HDAC1. Khi các chương trình nghiên cứu mở rộng quy mô để đánh giá nhiều mục tiêu mới liên quan đến chức năng epigenetic, cần có các thiết bị và kỹ thuật mới để cho phép sàng lọc biểu sinh thông lượng cao hiệu quả và có khả năng tái tạo. Công nghệ xét nghiệm Fluor de Lys của Enzo Life Science được sử dụng rộng rãi để đánh giá hoạt động của các chất ức chế hoạt động epigenetic. Các xét nghiệm này có thể dễ dàng thích ứng với sàng lọc thông lượng cao trên trạm máy Access (Hình 1). Trong nghiên cứu này, Bộ thao chất lỏng Echo đã được sử dụng để thu nhỏ xét nghiệm HDAC1 Fluor de Lys xuống tổng thể tích 3 μL trong các đĩa vi mô 384 giếng để sàng lọc tự động 10 đĩa. Trước khi tập hợp các xét nghiệm, 25 nL hợp chất thư viện epigenetic và chất ức chế đối chứng đã được chuyển bằng Echo 555 để tạo ra các đĩa sẵn sàng cho xét nghiệm. Sau đó, các đĩa sẵn sàng cho xét nghiệm được chuyển đến trạm máy Access có Bộ thao tác chất lỏng Echo 525 tích hợp để lắp ráp xét nghiệm hiệu suất cao, tự động. Trên trạm máy Access, thuốc thử xét nghiệm Fluor de Lys được phân phối từ Bình chứa đủ tiêu chuẩn Echo bằng Bộ thao tác chất lỏng Echo 525 (Hình 2). Việc sử dụng khả năng truyền năng lượng sóng âm được kích hoạt bởi Bộ thao chất lỏng Echo để tạo ra các đĩa sẵn sàng cho xét nghiệm và cung cấp thuốc thử Fluor de Lys đã tạo ra một xét nghiệm mạnh mẽ, tự động và thu nhỏ giúp xác định chính xác các chất ức chế HDAC1 đã biết.
Xét nghiệm Fluorogen HDAC1 Fluor de Lys
Bộ xét nghiệm hoạt động huỳnh quang/khám phá thuốc HDAC1 là một hệ thống xét nghiệm hoàn chỉnh được thiết kế để đo hoạt tính deacetylase của HDAC1 tái tổ hợp ở người. Hoạt tính deacetylase được đánh giá bằng cách đo sự chuyển đổi chất nền peptide được dán nhãn fluorophore.
Trong phản ứng enzyme, enzyme HDAC1 xúc tác quá trình loại bỏ chuỗi bên lysine acetyl hóa khỏi chất nền Fluor de Lys. Quá trình khử acetyl chất nền sẽ làm nhạy cảm chất nền để trong bước phát hiện, việc xử lý bằng Fluor de Lys Developer sẽ tạo ra chất fluorophore (Hình 3).
Sơ đồ được cung cấp bởi Enzo Life Sciences, Inc.
Phương pháp
Chuẩn độ enzyme HDAC1: Thí nghiệm 1
Hoạt tính enzyme của enzyme HDAC1 đã được nghiên cứu trong xét nghiệm Fluor de Lys Fluorogen của Enzo Life Science.
Phép chuẩn độ nối tiếp 12 điểm, 1:3 của HDAC1 đã được chuẩn bị trong dung dịch đệm khảo nghiệm được cung cấp trong bộ Fluor de Lys. 1,25 μL của mỗi độ pha loãng được chuyển ba lần cùng với 1,25 μL chất nền Fluor de Lys 10 μM từ tấm nguồn polypropylen đủ tiêu chuẩn Echo 384 giếng sang tấm xét nghiệm 384 giếng sử dụng Bộ thao tác chất lỏng Echo 525. Sau đó, đĩa được đậy kín và ủ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút. Sau khi ủ, 2,5 uL thuốc thử Trichostatin stop / hỗn hợp thuốc thử Developer II detection đã được thêm từ đĩa nguồn đủ tiêu chuẩn Echo 384 giếng vào đĩa xét nghiệm bằng bộ xử lý chất lỏng Echo 525. Đĩa được đậy kín lại và ủ trong 60 phút. Sau khi ủ, đĩa được đọc trên PHERAstar FS và tín hiệu Huỳnh quang được vẽ biểu đồ theo log nồng độ HDAC1 (Hình 4).
Chạy sàng lọc HDAC1 tự động: Thử nghiệm 2
Thư viện Hợp chất epigenetic SCREEN-WELL của Enzo Life Science chứa nhiều chất ức chế HDAC1 đã biết. Để xác định khả năng xác định chính xác các hợp chất ức chế của xét nghiệm HDAC1 Fluor de Lys, thư viện đã được kiểm tra trong quá trình chạy xét nghiệm tự động bằng cách sử dụng Bộ thao tác chất lỏng Echo 525 được tích hợp trên trạm máy Access.
Trước khi bắt đầu quá trình chạy tự động hóa, mười đĩa sẵn sàng cho xét nghiệm đã được chuẩn bị bằng Echo 555: bảy đĩa chứa chuẩn độ kiểm soát ức chế Trichlosatin A (TSA) và CUDC-907 cũng như các giếng kiểm soát biểu thị tín hiệu tổng và tín hiệu nền của xét nghiệm và ba đĩa chứa 6 bản sao trên mỗi đĩa của mỗi hợp chất thư viện trong 25 µM cũng như các phép chuẩn độ ức chế và biện pháp kiểm soát xét nghiệm nói trên.
| Tổng khối lượng | 5 µL | 2,4 µL |
| Hợp chất/Bộ đệm | 50 nL | 25 nL |
| enzym | 1,2 µL | 0,575 µL |
| Chất nền Fluor de Lys | 1,25 µL | 0,6 µL |
| Hợp chất Detection | 2,5 µL | 1,2 µL |
Bảng 1: Thể tích thuốc thử khảo nghiệm
Các đĩa xét nghiệm đã sẵn sàng được tải lên trạm máy Access. Bằng cách sử dụng phần mềm tự động hóa Tempo, một quy trình đã được thực hiện để tự động hóa việc lắp ráp xét nghiệm: các đĩa được chuyển đến hệ thống Echo để bổ sung các thành phần enzyme của xét nghiệm (theo thể tích trong Bảng 1) từ bể chứa đạt tiêu chuẩn Echo, sau đó đậy kín, ly tâm và ủ ở nhiệt độ phòng trong một giờ. Sau đó, các đĩa được tách niêm phong và chuyển đến Máy truyền thuốc thử Multidrop Combi của Thermo Fisher để bổ sung thuốc thử TSA stop/hỗn hợp thuốc thử Developer II detection, sau đó đậy kín, ly tâm và ủ trong một giờ ở nhiệt độ phòng trước khi đọc trên BMG Pherastar FS (xem Hình 5 để biết quy trình xét nghiệm). Phần trăm ức chế đối với các giá trị hỗn hợp thư viện và điều khiển được tính bằng công thức sau:((Tín hiệu tổng – tín hiệu mẫu)/(Tín hiệu tổng – tín hiệu nền))*100.
Đối với việc chuẩn độ chất ức chế đối chứng, các giá trị phần trăm ức chế được vẽ theo logarit của nồng độ chất ức chế.
Thảo luận
Chuẩn độ HDAC1: Thí nghiệm 1
Quá trình chuẩn độ enzyme HDAn HDAC1 được thực hiện bằng hệ thống Echo để truyền chính xác tất cả các thành phần xét nghiệm vào đĩa 384 giếng để đạt tổng thể tích 5 uL. Chuẩn độ HDAC 1 thể hiện dải động rộng và cung cấp cho người dùng thông tin về nồng độ enzyme thích hợp để sử dụng cho các thí nghiệm trong tương lai. Các thử nghiệm phát triển như thế này rất dễ thực hiện trên hệ thống Echo vì tất cả thuốc thử đều được cung cấp bằng năng lượng sóng âm, giúp giảm thời gian thực hiện và mức tiêu thụ thuốc thử. Dữ liệu thu được chỉ ra rằng 40 nM HDAC1 sẽ cung cấp đủ tín hiệu xét nghiệm cho quá trình sàng lọc.
Màn hình ghép HDAC1 tự động: Thí nghiệm 2
Quá trình sàng lọc HDAC1 gồm 10 tấm được thực hiện trên Trạm máy Access với Bộ thao tác chất lỏng Echo 525 tích hợp đã tạo ra dữ liệu chất lượng cao và các chất ức chế HDAC1 được xác định chính xác. Bộ điều khiển CUDC907 và TSA cho thấy sự ức chế rất nhất quán trong suốt quá trình chạy (Hình 6). Lần sàng lọc có giá trị Z’ đại diện là 0,72. Ngoài ra, các chất ức chế HDAC1 đã biết được xác định bằng giá trị phần trăm ức chế mạnh khi thử nghiệm ở 25 µM. Tính nhất quán của xét nghiệm cũng được thể hiện bằng các thanh lỗi nhỏ trong việc xác định phần trăm ức chế (Hình 7).
| 1. Trichostatin A | 16. Tranylcypromine hemisulfate | 31. BIX-01294 |
| 2. Axit 2,4-Pyridinedicarboxylic | 17. Axit valproic | 32. Butyrolacton 3 |
| 3. Garcinol | 18. Ex-527 | 33. CTPB |
| 4. Splitomycin | 19. Resveratrol | 34. Oxamflatin |
| 5. BML-210 | 20. M-344 | 35. Sirtinol |
| 6. Apicidin | 21. Nicotinamid | 36. Suramin·6Na |
| 7. Axit suberoyl bis-hydroxamic | 22. BML-266 | 37. BML-278 |
| 8. Hỗ trợ kịch bản | 23. Piceatannol | 38. NCH-51 |
| 9. Chữ rỗng | 24. Fluoro-SAHA | 39. CI-994 |
| 10. 5-Aza-2′-deoxycytidine | 25. Axit valproic hydroxamate | 40. NSC-3852 |
| 11. Zebularine | 26. AGK2 | 41. Aminoresveratrol sunfat |
| 12. SAHA | 27. Salermit | 42. BML-281 |
| 13. Isocotinamid | 28. MC-1293 | 43. Triacetylresveratrol |
| 14. ITSA-1 | 29. Axit Anacardic | |
| 15. Phenylbutyrat·Na | 30.B2 |
Tóm tắt
Quy trình công việc làm nổi bật tính linh hoạt của việc xử lý chất lỏng bằng sóng âm trong phòng thí nghiệm. Echo 555 được sử dụng để truyền nhanh chóng và chính xác một lượng nhỏ hợp chất và chất đối chứng vào các đĩa sẵn sàng cho xét nghiệm. Trạm máy Access có Bộ thao tác chất lỏng Echo 525 tích hợp đã tự động hóa hoàn toàn quá trình sàng lọc 10 tấm này. Bình chứa đủ tiêu chuẩn Echo được sử dụng để cung cấp các thuốc thử thông thường như enzyme HDAC1 và chất nền Fluor de Lys tới các đĩa xét nghiệm một cách chính xác và ít lãng phí thể tích do yêu cầu thể tích chết tối thiểu.
Việc sử dụng truyền chất lỏng bằng sóng âm trong quá trình xét nghiệm thu nhỏ này đã giúp xác định chính xác và hiệu quả các chất ức chế HDAC1 đã biết với mức tiết kiệm chi phí và tiêu thụ thuốc thử hơn 80%.
Nguyên vật liệu
Truy cập các thành phần máy trạm
| Thành phần | Nhà sản xuất |
| Truy cập máy trạm | Beckman Coulter Khoa học đời sống |
| Bộ thao tác chất lỏng Echo 525 | Beckman Coulter Khoa học đời sống |
| Hệ thống truyền chât lỏng Multidrop Combi | Thermo fisher |
| Máy ly tâm vi đĩa công nghệ Agilent | Agilent |
| Máy hàn vi bản nhiệt PlateLoc của Agilent Technologies | Agilent |
| Máy tách niêm phong tấm vi mạch Brooks Life Sciences XPeel | Brooks |
Thuốc thử xét nghiệm
| xét nghiệm | Sản xuất | Mã sản phẩm |
| HDAC1 tái tổ hợp của con người | Enzo | BML-SE465-0050 |
| Bộ xét nghiệm phát hiện thuốc bằng phương pháp đo huỳnh quang FLUOR DE LYS HDAC1 | Enzo | BML-AK511-0001 |
| Thư viện phức hợp epigenetic SCREEN-WELL | Enzo | BML-2836-0100 |
| Tấm nguồn polypropylen đủ tiêu chuẩn Echo 384 giếng | Beckman Coulter Scientific | 001-14555 |
| Ô chứa tiêu chuẩn Echo | Beckman Coulter Scientific | 001-11101 |
| Đĩa xét nghiệm 384 giếng | Greiner | 784075 |
| Trichostatin A | Selleckchem | S1045 |
| CUDC-907 | Selleckchem | S2759 |
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các Máy thao tác chất lỏng hãng Beckman Coulter.
EN