Một trong những ứng dụng đầu tiên của formaldehyde làm chất cố định mô đã được Tiến sĩ F.Blum phát hiện vào cuối thế kỷ 19. Tiến sĩ Blum không phải là nhà nghiên cứu bệnh học nhưng ông có mối quan tâm đến vi khuẩn học. Khi được một công ty hóa chất yêu cầu đánh giá một sản phẩm thương mại mới như một chất khử trùng (dung dịch formaldehyde), ông đã pha loãng nó theo tỷ lệ 1:10 để tạo ra dung dịch 4% và phát hiện ra rằng dung dịch này là một chất diệt khuẩn tốt nhưng tác dụng chậm. Ông cũng lưu ý rằng khi dung dịch lưu lại trên ngón tay của ông trong một thời gian ngắn, chúng sẽ trở nên cứng lại. Tính chất này giống như kiểu cứng mà ông ấy đã thấy đối với các chất cố định khác như cồn. Dựa trên quan sát của Blum, dung dịch 4% này vẫn duy trì tỷ lệ phần trăm được khuyến nghị để cố định formaldehyde và chưa bị thách thức mặc dù đã ghi nhận rõ ràng những tác động bất lợi mà việc cố định formalin gây ra đối với khả năng phản ứng miễn dịch của mô!
Tuy nhiên, từ quan điểm về tính nhất quán của hình dạng hiển vi sau quá trình xử lý parafin và cố định formalin nhuộm hematoxylin và eosin đã là sự lựa chọn của các nhà nghiên cứu bệnh học trong thế kỷ qua. Các nhà nghiên cứu bệnh học được đào tạo để giải thích các phần mô cố định bằng formalin và sự sai lệch khỏi phần này gây ra những thay đổi về hình thái mô và có thể gây ra các vấn đề trong chẩn đoán. Với việc sử dụng hóa mô miễn dịch ngày càng tăng trong chẩn đoán, vấn đề giảm khả năng nhận biết miễn dịch ở các mô được xử lý bằng parafin cố định bằng formalin có thể dẫn đến sự thay đổi trong việc lựa chọn chất cố định nếu kỹ thuật thu hồi kháng nguyên không được phát triển.
Khả năng miễn dịch
Mục tiêu chính của các nhà hóa học miễn dịch là đưa ra các quy trình tạo ra độ nhạy cao nhất mà không ảnh hưởng đến tính đặc hiệu. Chất lượng của kháng thể sơ cấp có ảnh hưởng rất lớn đến tính đặc hiệu, nhưng việc cố định mô có tác động lớn nhất đến độ nhạy của phương pháp hóa mô miễn dịch.
Việc cố định đơn thuần không gây ra hiện tượng mất khả năng nhận biết miễn dịch đối với các kháng nguyên mô. Khả năng nhận diện miễn dịch đối với một số kháng nguyên bị mất sau khi kết hợp cố định, xử lý mô và vùi parafin cụ thể. Kháng nguyên được chứng minh bằng chất cố định được sử dụng trên các phần đông lạnh có thể không được chứng minh sau khi sử dụng cùng một chất cố định cộng với quá trình xử lý tiếp theo, vùi parafin và chuẩn bị các phần parafin ngay cả khi sử dụng cùng một kháng thể trong cả hai quy trình nhuộm.
Formaldehyde làm biến tính các đại phân tử của mô, do đó làm cho các protein mô chứa phần lớn các kháng nguyên mô không thể tiếp cận được với các kháng thể chính được sử dụng trong hóa mô miễn dịch. Người ta đã chứng minh rằng các liên kết chéo do aldehyd gây ra có thể bị đảo ngược bằng cách đun nóng ở nhiệt độ cao hoặc bằng cách xử lý bằng kiềm mạnh. Shi và cộng sự đã áp dụng những kỹ thuật này cho các phần mô và chứng minh rằng tiền xử lý các phần được ngâm trong dung dịch kim loại nặng và đun nóng trong lò gia nhiệt làm tăng đáng kể độ nhạy của kỹ thuật hóa mô miễn dịch. Họ đặt tên cho kỹ thuật của mình là phương pháp “thu hồi kháng nguyên”. Thuật ngữ “thu hồi epitope do nhiệt” hay HIER đã trở thành thuật ngữ mô tả được chấp nhận rộng rãi. Trước HIER, việc sử dụng enzyme phân giải protein là phương pháp phổ biến nhất để đảo ngược tác dụng của quá trình cố định formalin (EIER). Việc lựa chọn protease, nồng độ và thời gian tiêu hóa của nó phần lớn là theo kinh nghiệm. Tuy nhiên, điều quan trọng là phải tối ưu hóa việc sử dụng enzyme được lựa chọn thay vì sử dụng nhiều loại enzyme.
Bản tóm tắt
Nền tảng của tất cả các chế phẩm mô học tốt là sự cố định thích hợp và xử lý mô tốt. Các yêu cầu gần đây đối với các phòng thí nghiệm nhằm giảm thời gian xử lý mẫu để chẩn đoán mô học thường dẫn đến việc thời gian cố định mẫu trong formalin bị rút ngắn.
Việc cố định kém hoặc không đủ sẽ dẫn đến khả năng bám parafin kém, dẫn đến việc tạo ra các phần parafin kém chất lượng. Các phần được cắt từ các khối mô được xử lý kém cho thấy khả năng chống chịu kém với sự khắc nghiệt của kỹ thuật thu hồi kháng nguyên và dễ bị mất. Hình thái bị suy yếu và các kháng nguyên có thể bị mất hoặc trở nên khuếch tán.
Bất chấp các vấn đề liên quan đến việc cố định formalin, tầm quan trọng của khía cạnh này của kỹ thuật mô học cơ bản không bao giờ được thỏa hiệp nếu muốn đạt được phương pháp nhuộm miễn dịch chất lượng cao.
Số liệu cố định mô
Các yếu tố chính cho quá trình tiêu hóa enzyme
Các yếu tố chính cho quá trình tiêu hóa enzyme là:
- Nhiệt độ
- pH
- Nồng độ enzyme
- Thời gian tiêu hóa
Để nhuộm hóa mô miễn dịch tối ưu, thời gian tiêu hóa là rất quan trọng và phụ thuộc vào thời gian cố định trong formaldehyde. Các mô được cố định bằng formalin trong thời gian dài thường đòi hỏi phải tiếp xúc lâu dài với enzyme phân giải protein. Có thể nhận thấy rằng thời gian tiêu hóa thay đổi do hoạt động của enzym thay đổi theo từng mẻ. Một hạn chế khác khi thu hồi kháng nguyên bằng enzyme là các mô kém cố định dễ bị tiêu hóa quá mức dẫn đến mất chi tiết hình thái.
Khi không biết lịch trình xử lý cố định và parafin, như trong trường hợp các khối và phần mô được tham chiếu, có thể cần phải thực hiện một loạt thời gian tiêu hóa để đạt được kết quả hóa học miễn dịch tối ưu.
HIER có một số ưu điểm và nhược điểm. Ưu điểm chính là thời gian gia nhiệt để lấy kháng nguyên có xu hướng đạt tiêu chuẩn, bất kể thời gian cố định. Các ưu điểm khác bao gồm:
- Tăng cường độ nhuộm màu
- Sự biểu hiện các kháng nguyên thường không thể hiện được trong mô cố định bằng formalin
- Sản xuất phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch chất lượng cao, nhất quán, đáng tin cậy đối với các kháng nguyên mô nhạy cảm với formalin.
Việc tiêu chuẩn hóa các quy trình cơ bản được sử dụng trong mô bệnh học như cố định, xử lý mô và xử lý các phần mô trước khi nhuộm miễn dịch sẽ góp phần lớn trong việc cải thiện hiệu suất của phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, việc xử lý mô còn lâu mới được tiêu chuẩn hóa. Công thức của chất cố định được sử dụng, ví dụ như NBF, formal saline hoặc việc sử dụng các dung dịch formalin khác như formal calcium, theo truyền thống được giao cho mỗi phòng thí nghiệm riêng lẻ. Điều tương tự cũng đúng với việc lựa chọn thuốc thử xử lý mô và thời gian xử lý mô. Việc thiếu tiêu chuẩn hóa các quy trình cơ bản của mô học dẫn đến việc chuẩn bị một chế phẩm độc đáo – một khối mô độc đáo và đặc trưng của phòng thí nghiệm đã tạo ra nó. Sau đó, các phần được cắt từ một khối như vậy sẽ cung cấp chất nền cho các nghiên cứu hóa mô miễn dịch có thể rất khác với các phần được cắt từ vật liệu đã được cố định, xử lý và cắt ở nơi khác. Khi xử lý vật liệu như vậy, điều cần thiết là nhân viên phòng thí nghiệm phải hiểu các vấn đề và thách thức liên quan đến vật liệu được tham chiếu và phải nhận thức đầy đủ về các cách thức vận dụng các giao thức đã được thiết lập để tạo ra chất nhuộm miễn dịch chất lượng cao.
Hóa mô miễn dịch thành công có thể được coi là sự tích hợp chính xác của một số thông số kỹ thuật. Mục đích của hóa mô miễn dịch là đạt được sự biểu hiện nhất quán và khả năng tái tạo các kháng nguyên với mức độ nhuộm nền tối thiểu trong khi vẫn bảo tồn tính toàn vẹn của cấu trúc mô. Việc cố định và xử lý parafin tiếp theo là một điều cần thiết phải xem xét.
Sự cố định đầy đủ và thích hợp là nền tảng của tất cả các chế phẩm mô học và hóa học miễn dịch. Sự cố định lý tưởng là sự cân bằng giữa hình thái tốt và tính kháng nguyên tốt. Việc cố định kém hoặc cố định chậm sẽ gây mất tính kháng nguyên hoặc khuếch tán kháng nguyên vào các mô xung quanh. Các khối cố định kém không được xử lý thành parafin đầy đủ. Cồn được sử dụng trong các bước khử nước trong quá trình xử lý mô là một chất cố định và khử nước tối ưu. Tuy nhiên, nếu được yêu cầu thực hiện cả hai vai trò như chất cố định và chất khử nước, như với các khối mô cố định kém, nó sẽ không đạt được cả hai điều đó và do đó dẫn đến khối được xử lý kém sẽ là sản phẩm cuối cùng. Tuy nhiên, trong những trường hợp như vậy, tất cả có thể không bị mất vì quá trình tái xử lý có thể được thực hiện và nhuộm hóa mô miễn dịch hợp lý có thể đạt được đối với hầu hết các kháng nguyên.
Trường Cao đẳng Bệnh học Hoa Kỳ (hướng dẫn ASCO-CAP) đã cố gắng giải quyết vấn đề tiêu chuẩn hóa việc cố định mô vú ở Hoa Kỳ. Khuyến nghị của họ là mô phải được cố định tối thiểu 6 giờ và tối đa 48 giờ trong NBF. Formalin đệm trung tính phải được bảo quản dưới 1 tháng. Các mô cố định không thể xử lý ngay thành parafin nên được bảo quản trong cồn 70% cho đến khi xử lý. Cho đến nay ở Anh không có khuyến cáo chính thức nào về loại chất cố định hoặc thời gian cố định. Một nghiên cứu được thực hiện bởi Goldstein và cộng sự năm 2003 đã chứng minh rằng hóa mô miễn dịch thụ thể estrogen âm tính giả có thể xảy ra nếu sinh thiết vú, sinh thiết lõi kim và mẫu cắt bỏ được cố định trong thời gian ít hơn 6-8 giờ. Do đó, người ta thường cho rằng tốt nhất là cố định mô qua đêm thay vì xử lý mẫu nhanh bằng parafin trong cùng ngày làm việc. Lượng chất cố định được sử dụng lý tưởng nhất là gấp 15-20 lần lượng mô cần cố định. Các mô được chọn để cắt phải đủ mỏng để có thể cố định được trong thời gian hợp lý. Phần lớn mô xác định thể tích cố định cần thiết và độ dày của mẫu vật sẽ quyết định tốc độ cố định.
Pha loãng tối ưu kháng thể sơ cấp
Độ pha loãng tối ưu của kháng thể sơ cấp cho hóa học miễn dịch tế bào là nồng độ của kháng thể chính cho phép nhuộm đặc hiệu tối ưu với lượng thuốc nhuộm nền ít nhất. Độ pha loãng tối ưu sẽ phụ thuộc vào loại và thời gian cố định. Do đó, điều quan trọng nhất đối với từng phòng thí nghiệm là tìm ra độ pha loãng (hiệu giá) của kháng thể chính mang lại kết quả tốt nhất bằng cách sử dụng hệ thống phát hiện hóa mô miễn dịch ưa thích của họ. Vì vậy, rất hiếm khi các phòng thí nghiệm riêng lẻ sử dụng các dung dịch pha loãng kháng thể chính giống hệt nhau mặc dù họ có thể sử dụng phương pháp hóa mô miễn dịch chứng minh giống hệt nhau.
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các thiết bị Giải phẫu bệnh từ hãng Leica Biosystems.
EN