Giới thiệu
Đếm tế bào dòng chảy là một công cụ nghiên cứu quan trọng để mô tả nhanh chóng quần thể tế bào trong huyền phù. Những công cụ tiên tiến và thuốc thử huỳnh quang đã giúp thực hiện các thí nghiệm phân tích tế bào dòng chảy thông lượng cao. Nhiều giao thức nghiên cứu đếm tế bào dòng chảy sử dụng kháng thể được gắn nhãn huỳnh quang để đo biểu hiện protein hoặc xác định loại tế bào trong quần thể không đồng nhất. Xác định nồng độ/titer kháng thể chính xác để sử dụng trong một thí nghiệm nhất định là một thông số kiểm soát chất lượng quan trọng. Sử dụng quá ít kháng thể có thể dẫn đến việc gắn nhãn không đầy đủ, trong khi sử dụng quá nhiều kháng thể có thể dẫn đến tăng huỳnh quang nền và liên kết kháng thể với các vị trí có ái lực thấp.
Vì việc thực hiện định lượng kháng thể có thể tốn nhiều công sức, thời gian và dễ xảy ra lỗi của con người, chúng tôi đã tìm cách tự động hóa quy trình này bằng cách sử dụng hệ thống Biomek i7 tích hợp với máy đếm tế bào dòng chảy CytoFLEX LX (Hình 1). Biomek i7 là một hệ thống xử lý chất lỏng tự động có khả năng thực hiện hiệu quả các bước xử lý chất lỏng phức tạp của quy trình đếm tế bào dòng chảy, bao gồm cả chuẩn độ kháng thể. Điều này giảm thiểu số lần tương tác cần thiết của người dùng, giúp người vận hành có thể tham gia vào các công việc nghiên cứu khác
Chúng tôi tiếp tục hợp lý hóa quy trình làm việc để định lượng kháng thể bằng phần mềm Cytobank, có thể thực hiện cả phân tích dữ liệu và tính toán Chỉ số nhuộm (SI) trong một chương trình. Theo truyền thống, bước này thường yêu cầu phân tích dữ liệu đếm tế bào dòng chảy trong một chương trình phần mềm với việc xuất số liệu thống kê sang một chương trình khác để tính Chỉ số nhuộm và biểu diễn đồ họa kết quả định lượng kháng thể.
Chúng tôi trình bày dưới đây một quy trình làm việc tự động và hợp lý cho các thí nghiệm định lượng kháng thể bằng cách sử dụng các giải pháp phòng thí nghiệm có sẵn từ Beckman Coulter Life Sciences (Hình 2) .
| A
|
B
|
C
|
Hình 1. A) *Hệ thống chuẩn bị mẫu Biomek i7 tích hợp Máy đếm tế bào dòng chảy CytoFLEX LX. B) Giá đỡ máy Biomek i7 và CytoFLEX LX. C) Quá trình nạp tự động đĩa 96 giếng vào máy đếm tế bào dòng chảy CytoFLEX LX bằng kẹp Biomek.
*Chỉ dùng cho mục đích nghiên cứu. Không dùng trong các thủ thuật chẩn đoán.
Hình 2. Quy trình chuẩn độ kháng thể tự động và hợp lý hóa. Các bước tự động sử dụng Biomek i7 tích hợp máy đếm tế bào dòng chảy CytoFLEX LX. Ước tính thời gian cho pha loãng tuần tự ba kháng thể và nhuộm tế bào bằng tám nồng độ (tổng cộng 24 giếng) được hiển thị bên dưới mỗi bước trong sơ đồ quy trình. Phân tích dữ liệu hợp lý hóa và tính toán Chỉ số nhuộm (SI) được thực hiện bằng phần mềm Cytobank.
Vật liệu và phương pháp
Mẫu PBMC
Tế bào đơn nhân máu ngoại vi chính (PBMC) của người mua từ ATCC (mã số PCS-800-011), rã đông, rửa hai lần và tái huyền phù bằng môi trường RPMI-1640 bổ sung 10% FBS. Nồng độ và khả năng sống của tế bào sau đó được đánh giá bằng ống đếm DURAClone IM. Nồng độ tế bào mẫu PBMC sau đó được điều chỉnh thành khoảng 10 x 106 /mL trong môi trường RPMI-1640 bổ sung 10% FBS.
Thuốc thử
| *Thuốc thử | Supplier | Part Number |
| RPMI-1640 | HyClone | SH30255.01 |
| FBS (heat inactivated) | Gibco | 10082-147 |
| DURAClone IM Count Tube | Beckman Coulter | C00162 |
| PBS (1X) Buffer | Gibco | 10082-147 |
| Cell Staining Buffer | BioLegend | 420201 |
| ViaKrome 561 Fixable Viability Dye | Beckman Coulter | C36620 |
| Anti-human CD4-Pacific Blue | Beckman Coulter | A82789 |
| Anti-human CD8-APC | Beckman Coulter | 200065 |
| Anti-human CD19-Alexa Fluor® 700 (Alexa Fluor® 700 carboxylic acid, succinimidyl ester, tris [triethylammonium salt]) (A700) | Beckman Coulter | 200028 |
*Chỉ dùng cho mục đích nghiên cứu. Không dùng trong các thủ thuật chẩn đoán.
Vật tư tiêu hao Biomek i7
| Đồ dùng phòng thí nghiệm | Nhà cung cấp | Số bộ phận |
| Biomek i-Series, đầu pipet 90 µL, vô trùng | Beckman Coulter | B85884 |
| Biomek i-Series, đầu pipet 230 µL, vô trùng | Beckman Coulter | B85906 |
| Biomek i-Series, đầu pipet 1070 µL, vô trùng | Beckman Coulter | B85945 |
| Đĩa đáy chữ U 96 giếng, polystyrene | Greiner Bio-One | 650101 |
| Đĩa PCR có viền 96 giếng | Bio-Rad | HSP9601 |
Pha loãng kháng thể tự động
Tất cả các dụng cụ phòng thí nghiệm, thuốc thử và mẫu cần thiết đã được nạp vào Biomek i7 Multichannel như thể hiện trong Hình 3A. Pha loãng kháng thể được thực hiện bởi pod Multichannel bằng cách sử dụng bước pha loãng tuần tự trong phần mềm Biomek 5. Kháng thể được pha loãng tuần tự gấp 2 lần trong một tấm PCR có viền 96W trong đệm nhuộm tế bào theo cách hàng để đạt được nồng độ kháng thể trong khoảng từ gấp đôi nồng độ khuyến nghị (2X) xuống đến 0,03X. Giữa mỗi lần thêm bước pha loãng tuần tự, nội dung giếng được trộn ba lần trước bước pha loãng tuần tự tiếp theo.
Nhuộm và rửa mẫu PBMC tự động
PBMC được hút bằng pipet theo từng phần 100 µL vào các giếng được chỉ định của một đĩa thử nghiệm đáy chữ U 96W. Tiếp theo, 20 µL (2X) và 10 µL (1X) của mỗi kháng thể gốc được thêm vào các giếng được chỉ định của đĩa thử nghiệm, sau đó thêm 10 µL của mỗi pha loãng nối tiếp kháng thể vào các giếng được chỉ định của đĩa thử nghiệm. Các mẫu được thiết bị trộn mẫu tự động chuyển động lắc theo quỹ đạo (ALP), đậy bằng nắp có lá kim loại và ủ trên Biomek trong 15 phút, điều kiện tối. Sau đó, các mẫu được rửa bằng cách hút 100 µL dung dịch nhuộm tế bào vào mỗi giếng và đĩa thử nghiệm được ly tâm ở tốc độ 1000 vòng/phút trong 5 phút bằng máy ly tâm đĩa vi tấm tích hợp (Agilent). Sau khi các tế bào được tạo thành, 165 µL dung dịch nổi thu được được loại bỏ để đạt được thể tích còn lại là 45 µL. Tiếp theo, 5 µL dung dịch pha loãng ViaKrome 561 Fixable Viability Dye (FVD) được thêm vào mỗi giếng sử dụng, sau đó đĩa được lắc để trộn hỗn hợp tế bào/thuốc nhuộm, đậy bằng nắp có lớp giấy bạc và ủ trong 15 phút trong điều kiện tối. Sau đó, tế bào được rửa (như trên) bằng cách thêm 150 µL dung dịch đệm nhuộm tế bào, quay ly tâm và loại bỏ 150 µL dung dịch nổi. Bước rửa được lặp lại với 200 µL dung dịch đệm nhuộm tế bào mỗi giếng. Cuối cùng, 150 µL dung dịch đệm nhuộm tế bào được pipet vào mỗi giếng, trộn bằng máy lắc theo quỹ đạo và đĩa được tự động đưa vào máy đếm tế bào dòng chảy CytoFLEX LX tích hợp Biomek gripper. Các mẫu được thu thập bằng một thí nghiệm đã được lập trình trước trong phần mềm CytExpert và quá trình thu thập các giếng mẫu được giám sát theo thời gian thực qua Run Time Data Viewer (Hình 3B) trên màn hình máy tính điều khiển Biomek.
| A
|
B
|
Hình 3. Phương pháp tự động. A) Bố trí layout cho phương pháp tự động. Thiết bị cần thiết bao gồm các ALPS, thiết bị và tích hợp sau4 tip loading (TL) ALPs, 7 1×1 ALPs, ALP chuyển động lắc, máy ly tâm đĩa vi tấm (Agilent) và máy đếm dòng chảy tế bào CytoFLEX LX. B) Việc thu thập mẫu đo lưu lượng tế bào tự động được theo dõi trên PC điều khiển Biomek bằng Run Time Data Viewer.
Thu thập dữ liệu tế bào dòng chảy
Các mẫu được lấy trên máy đếm tế bào dòng chảy CytoFLEX LX bằng phần mềm thu thập CytExpert. PBMC được phân loại bằng biểu đồ chấm FSC so với SSC và một vùng được vẽ để bao gồm quần thể tế bào lympho. Các tế bào lympho SỐNG và CHẾT được phân loại bằng biểu đồ chấm ViaKrome 561 so với SSC với cổng tế bào lympho được áp dụng và các vùng được vẽ để bao gồm các tế bào lympho SỐNG (ViaKrome FVD 561-) và các tế bào lympho CHẾT (ViaKrome FVD 561+). Một số lượng dừng được áp dụng để ghi lại 30.000 tế bào lympho SỐNG từ mỗi giếng mẫu (Hình 4) . Huỳnh quang được đo cho mỗi kháng thể liên hợp trực tiếp bằng cách sử dụng đầu dò thích hợp phù hợp với tiêu chí kích thích và phát xạ huỳnh quang.
Hình 4. Thu thập mẫu CytExpert. Tế bào lympho được phân loại bằng biểu đồ chấm FSC so với SSC và một vùng được vẽ để bao gồm quần thể tế bào lympho. Tế bào lympho SỐNG và CHẾT được phân loại bằng biểu đồ chấm ViaKrome 561 FVD so với SSC với cổng Lymphs được áp dụng và các cổng được vẽ để bao gồm quần thể tế bào lympho SỐNG (ViaKrome 561 -) và CHẾT (ViaKrome 561+).
Phân tích dữ liệu trong phần mềm Cytobank
Chiến lược phân tích mẫu trong phần mềm CytExpert đã được sao chép trong Gating Editor của nền tảng Cytobank và các đỉnh quần thể dương tính và âm tính được xác định bằng cách sử dụng biểu đồ histogram với bộ phát fluorochrome thích hợp được chọn cho trục X. (Hình 5).
Các thẻ mẫu trên nền tảng Cytobank được gán cho mỗi ống để xác định nồng độ kháng thể và các thuốc thử một cách phù hợp. Chỉ số Nhuộm (Stain Index, SI) được tự động tính toán trên nền tảng bằng cách bật thanh trượt trong menu Plot của Illustration Editor.”
Hình 5. Biểu đồ dữ liệu đại diện của PBMC nhuộm bằng kháng thể CD4-Pacific Blue : Biểu đồ tham số đơn cho thấy các đỉnh huỳnh quang âm tính và dương tính của CD4-Pacific Blue có nguồn gốc từ cổng tế bào lympho SỐNG trong mẫu PBMC nhuộm bằng 20 µL kháng thể.
Kết quả
Đường biểu diễn định lượng kháng thể và biểu đồ histogram chồng lấn (Hình 6 và Hình 7) được tạo ra cho ba dấu hiệu tế bào dòng chảy thường dùng: CD8, CD19 và CD4. Đối với mỗi kháng thể, Chỉ số nhuộm (SI) được vẽ biểu đồ theo hàm của nồng độ kháng thể. Đối với mỗi kháng thể, chỉ có sự khác biệt tối thiểu được quan sát thấy giữa nồng độ kháng thể được khuyến nghị (1X) và gấp đôi giá trị được khuyến nghị (2X). Sự khác biệt giữa nồng độ 1X và pha loãng gấp đôi (0,5X) thay đổi theo cách phụ thuộc vào kháng thể, làm nổi bật lý do tại sao nồng độ kháng thể tối ưu nên được xác định trước khi chạy các thí nghiệm tế bào dòng chảy phức tạp.
Dữ liệu với kháng thể CD8-APC cho thấy nồng độ kháng thể 1X và 0,5X biểu hiện các giá trị SI rất khác nhau. Kháng thể CD8-APC biểu hiện giá trị SI là 245,9 đối với nồng độ 1X nhưng chỉ là 146,9 đối với điều kiện 0,5X; điều này thể hiện mức giảm tín hiệu khoảng 40%. Ngược lại, sự khác biệt về SI đối với 1X so với 0,5X với kháng thể CD19-AF700 lại ở mức vừa phải hơn, vì việc giảm nồng độ kháng thể 50% dẫn đến giảm 13% SI (68,8 đối với 1X so với 59,9 đối với 0,5X). Đối với CD4-Pacific Blue, chúng tôi xác định rằng có thể sử dụng một nửa nồng độ kháng thể được khuyến nghị với tác động tối thiểu đến chất lượng dữ liệu, vì các giá trị SI lần lượt là 47,9 và 44,0 đối với nồng độ kháng thể CD4-Pacific Blue 1X và 0,5X.
Hình 6. Đường biểu diễn chuẩn độ kháng thể và bảng dữ liệu tóm tắt cho kháng thể CD8-APC, CD19-AF700 và CD4-Pacific Blue. Biểu đồ hiển thị Chỉ số nhuộm (SI) so với lượng thể tích kháng thể với các giá trị Chỉ số nhuộm thực tế cho mỗi chuẩn độ kháng thể được hiển thị bên dưới.
Hình 7. Biểu đồ chồng của các tham số đơn cho hiệu giá kháng thể CD8-APC, CD19-AF700 và CD4-Pacific Blue với Cường độ huỳnh quang trung bình thực tế cho mỗi hiệu giá kháng thể được hiển thị bên dưới.
Biểu đồ chấm cũng được tạo bằng cách sử dụng các tệp FCS nối tiếp cho mỗi kháng thể được thử nghiệm (Hình 8) . Kiểu trực quan hóa này hữu ích để hiển thị quần thể dương tính và âm tính trong một biểu đồ 2D duy nhất và nó cũng biểu thị trực quan sự lây lan của quần thể âm tính có thể xảy ra khi lượng kháng thể tăng lên.
Hình 8. Biểu đồ chấm được tạo trong phần mềm Cytobank bằng cách sử dụng các tệp FCS được nối cho các chuẩn độ kháng thể CD8-APC, CD19-AF700 và CD4-Pacific Blue. Việc nối các tệp FCS thô được thực hiện bằng công cụ FCS trong Cytobank Support menu.
Đối với thí nghiệm này, chúng tôi đã chọn thể tích chuẩn độ kháng thể tối ưu là 10 µL (1X lượng do nhà cung cấp khuyến nghị) cho mỗi một trong ba kháng thể được thử nghiệm, vì đây là lượng kháng thể cho thấy sự tách biệt tốt nhất giữa các tế bào âm tính và dương tính theo phép tính SI. Bảng 1 bên dưới hiển thị nồng độ kháng thể dự trữ thực tế (μg/mL) và thể tích chuẩn độ tối ưu (µL) cùng với nồng độ kháng thể tối ưu (μg) cho số lô cụ thể của các kháng thể được thử nghiệm.
| Kháng thể | Nồng độ dự trữ (μg/mL) | Thể tích Titer tối ưu (μL) | Nồng độ Titer tối ưu (μg) |
| CD4-Pacific Blue | 50 | 10 | 0,5 |
| CD8-APC | 6,25 | 10 | 0,06 |
| CD19-Alexa Fluor 700 | 25 | 10 | 0,25 |
Bảng 1. Định lượng kháng thể tối ưu: Nồng độ lô kháng thể cụ thể thu được từ tài liệu Chứng nhận phân tích. Thể tích định lượng kháng thể tối ưu (μL) và nồng độ (μg) đối với CD4-Pacific Blue, CD8-APC và CD19-Alexa Fluor 700 để nhuộm PBMC được xác định từ thí nghiệm định lượng kháng thể tự động.
Tóm tắt
Định lượng kháng thể tối ưu để sử dụng trong một nghiên cứu đếm tế bào dòng chảy nhất định là điều cần thiết để tạo ra dữ liệu chất lượng cao nhưng liên quan đến việc pha loãng kháng thể theo chuỗi tốn nhiều công sức và thời gian và các bước nhuộm tế bào tiếp theo, rất dễ xảy ra lỗi. Tự động hóa các bước định lượng kháng thể trên hệ thống chuẩn bị mẫu Biomek i7 có thể loại bỏ hoặc giảm số bước xử lý thủ công, giảm lỗi của con người và giảm thiểu tương tác của người dùng cho phép người vận hành có thể tham gia vào các công việc nghiên cứu khác
Việc giải thích dữ liệu định lượng kháng thể để xác định giá trị tối ưu có thể được thực hiện bằng một số phương pháp khác nhau. Trong phần mềm Cytobank, người ta có thể dễ dàng tạo các đường định lượng, Chỉ số nhuộm tự động với bảng Thống kê Chỉ số nhuộm được kết nối, biểu đồ lớp phủ và ngoài ra, người ta có thể sử dụng các tệp FCS nối tiếp để tạo một biểu đồ chấm 2D duy nhất để hiển thị quần thể dương tính và âm tính và để biểu thị sự lan rộng của quần thể âm tính.
Chúng tôi đã chứng minh trong App Note này một giải pháp mạnh mẽ và thực sự dễ dàng để thực hiện chuẩn độ kháng thể với sự tích hợp của máy đếm dòng chảy tế bào CytoFLEX LX với hệ thống Biomek i7 từ hãng Beckman Coulter Life Sciences. Ngoài ra, chúng tôi đã trình bày một quy trình phân tích dữ liệu hợp lý để xác định lượng kháng thể tối ưu bằng cách sử dụng phần mềm Cytobank.
Tài liệu tham khảo
- Maecker TH, Frey T, Nomura LE, Trotter J. Chọn liên hợp fluorochrome để có độ nhạy tối đa. Cytometry Phần A 2004; 62A:169–173.
- Davis BH, Wood B, Oldaker T, Barnett D. Xác nhận các xét nghiệm huỳnh quang dựa trên tế bào: hướng dẫn thực hành từ ICSH và ICCS, Cytometry B Clin Cytom 2013 84B: 291-308.
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp Hệ thống chuẩn bị mẫu tự động và Máy đếm tế bào dòng chảy từ hãng Beckman Coulter.
EN