Giới thiệu
Virus liên hợp Adeno (AAV) là các vectơ vận chuyển mạnh mẽ cho liệu pháp gen. Tuy nhiên, trong quá trình tự lắp ráp, AAV đóng gói vật liệu di truyền một cách kém hiệu quả, dẫn đến chỉ một phần nhỏ các hạt virus thực sự mang gen mục tiêu. Việc làm giàu các hạt virus AAV được nạp đầy (mang đủ vật liệu di truyền) là một bước quan trọng trong quy trình tinh sạch hạ nguồn, và được thực hiện hiệu quả nhất bằng phương pháp siêu ly tâm theo gradient mật độ Cesium Chloride (CsCl), được xem là tiêu chuẩn vàng. Mặc dù phương pháp CsCl-DGUC có thể đạt được hơn 95% hạt AAV đầy một cách thường xuyên, nhưng thời gian ly tâm với gradient tuyến tính trong rotor thường kéo dài 16 giờ hoặc hơn. Thời gian chạy kéo dài này có thể khiến tổng thời gian xử lý kéo dài đến 2–3 ngày, làm hạn chế năng suất.
Để giải quyết thách thức cốt lõi này, Beckman Coulter đã phát triển một giải pháp tự động có tên là OptiMATE Gradient Maker. Hệ thống này có khả năng phân phối gradient tuyến tính đồng thời tích hợp được các thể tích mẫu lớn. Bởi vì thời gian kéo dài trong quy trình siêu ly tâm theo gradient mật độ (DGUC) chủ yếu bắt nguồn từ quá trình hình thành gradient diễn ra chậm, nên việc sử dụng gradient tuyến tính được tạo sẵn sẽ cho phép tách mẫu nhanh hơn đáng kể. Trong trường hợp sử dụng gradient tạo sẵn, thời gian chạy chủ yếu phụ thuộc vào quá trình di chuyển của các hạt trong mẫu (và sự thay đổi nhẹ của cấu hình gradient theo điều kiện vận hành). OptiMATE Gradient Maker còn giúp loại bỏ các bước chuẩn bị thủ công trong quá trình tạo gradient, từ đó mang lại sự nhất quán, chính xác cao và dễ sử dụng. Tài liệu ứng dụng này chứng minh khả năng tinh sạch tự động, độ phân giải cao của các capsid AAV đầy chỉ trong 5 giờ. Đồng thời, xác nhận tính tương đương về các thuộc tính chất lượng quan trọng (CQA) so với quy trình thủ công truyền thống kéo dài ≥ 16 giờ.
Phương pháp
Phân tích cấu hình gradient
Đầu tiên, tiến hành so sánh các biểu đồ gradient mật độ giữa các ống được tạo bởi OptiMATE Gradient Maker và các ống được tạo thủ công (Hình 1). Trong thí nghiệm này, cả hai ống Quick-Seal Round-Top Ultra-Clear 13,5 mL và 39 mL đều được sử dụng để đại diện cho các kích thước ống và rotor thường dùng trong tinh chế AAV.
Các thông số được sử dụng để tạo hồ sơ gradient mật độ được hiển thị trong Bảng 1. Các phương pháp được tạo trên OptiMATE Gradient Maker để phân phối các gradient mật độ tuyến tính giữa mật độ giới hạn trên và dưới được xác định trước (với mật độ ống trung bình là 1,35 g/mL) bằng cách sử dụng OptiMATE Cesium Chloride và nước nano tinh khiết làm chất pha loãng. Song song đó, các ống được đổ thủ công hỗn hợp đồng nhất gồm dung dịch Cesium Chloride OptiMATE và nước đến mật độ ban đầu là 1,35 g/mL và được bịt kín bằng Cordless Tube Topper. Các ống được ly tâm trong máy siêu ly tâm Optima XPN-90 . Các ống gradient mật độ tuyến tính được định hình sẵn do OptiMATE Gradient Maker phân phối (sau đây gọi là ống gradient định hình sẵn) được ly tâm trong 4 giờ trong khi các ống CsCl mật độ đồng nhất 1,35 g/mL (sau đây gọi là ống gradient tự hình thành) được ly tâm trong 20 giờ để cho phép gradient mật độ tự hình thành. Sau khi ly tâm, hàm lượng của các ống được phân đoạn và thu hồi bằng cách chọc thủng đáy. Các phân đoạn này được phân tích bằng khúc xạ kế để đánh giá độ chênh lệch nồng độ. Để kiểm tra sự biến thiên nồng độ, các ống được phân phối bằng OptiMATE Gradient Maker được phân đoạn ngay sau khi phân phối (không ly tâm) và phân tích bằng khúc xạ kế.
| Tham số | Ống 13,5 mL | Ống 39 mL |
|---|---|---|
| Tổng thể tích (mL) | 13,5 | 39 |
| Loại ống | Quick-Seal Round-Top Ultra-Clear | |
| Rotor | 70,1 Có | Loại 70 Ti |
| Tốc độ siêu ly tâm (vòng/phút) | 60.000 | |
| Tốc độ siêu ly tâm (xg) | 329, 738 | 369, 548 |
| Mật độ trung bình (g/mL) | 1,35 | |
| Mật độ giới hạn trên của gradient được tạo sẵn (g/mL) | 1.2 | 1.14 |
| Mật độ giới hạn dưới của gradient được tạo sẵn (g/mL) | 1,5 | 1,56 |
| Kích thước phân số ước tính được thu thập (mL) | 1.2 | 1.7 |
Bảng 1. Các thông số cho quá trình siêu ly tâm gradient mật độ CsCl đối với gradient tự hình thành (thủ công) và gradient được tạo sẵn (OptiMATE Gradient Maker).
Hình 1. Sơ đồ thí nghiệm kiểm soát gradient mật độ so sánh (a) phân phối tự động gradient CsCl đã định hình sẵn và (b) phân phối thủ công gradient CsCl tự định hình. Ống tiêm thể hiện quá trình phân đoạn dưới đáy.
Tinh sạch AAV
Huyết thanh AAV 9 (AAV9) được biểu hiện bằng phương pháp chuyển gen ba lần trong tế bào HEK-293. Sau khi biểu hiện, tế bào được ly giải, ly tâm và AAV thô được tiến hành sắc ký ái lực để làm giàu ban đầu tất cả các loại capsid. Vật liệu bán tinh khiết này được sử dụng làm mẫu AAV cho thí nghiệm.
Đối với cả gradient mật độ CsCl tự hình thành và được tạo sẵn, OptiMATE Cesium Chloride đã được sử dụng, với mẫu AAV là chất pha loãng (Hình 2). 5 x 1013 bộ gen virus (vgs) của AAV được nạp vào mỗi ống 13,5 mL và 1 x 1014 vgs của AAV được nạp vào mỗi ống 39 mL. Người ta đã cẩn thận để đảm bảo rằng, mặc dù có sự khác biệt trong phương pháp chuẩn bị cho gradient mật độ được tạo sẵn và tự hình thành, một lượng AAV bằng nhau đã được sử dụng cho mỗi ống. Các thông số quy trình giống nhau được sử dụng để tạo hồ sơ gradient mật độ (Bảng 1) đã được sử dụng để chuẩn bị các ống để tinh chế AAV. Tuy nhiên, trong trường hợp này, thời gian chạy siêu ly tâm là 5 giờ đã được sử dụng cho gradient mật độ được tạo sẵn. Toàn bộ quy trình được trình bày chi tiết trong Hình 2.
Sau khi ly tâm, các dải capsid đầy đủ của AAV được chiết xuất thông qua chọc thủng bên và vật liệu thu hồi được trao đổi đệm thành 1x PBS + 0,01% Poloxamer 188. Chất lượng của quá trình phân tách được đánh giá bằng cách kiểm tra độ tinh khiết của capsid đầy đủ trong mẫu thu hồi bằng Máy ly tâm siêu phân tích Optima (AUC) có độ hấp thụ ở 230 nm.
Hình 2. Sơ đồ tinh sạch AAV so sánh (a) phân phối tự động một gradient CsCl được tạo sẵn và (b) phân phối thủ công một gradient CsCl tự hình thành. Mẫu AAV được phân tách thành các dải có thể nhìn thấy (vỏ rỗng – màu xanh lam; vỏ đầy – màu đỏ) vào cuối quá trình ly tâm, được thu hồi bằng cách chọc thủng thành ống bằng xi lanh và chiết xuất dải.
Quá trình chuẩn bị ống
Hình 3 mô tả sự so sánh giữa công sức và thời gian thực hành liên quan đến việc phân phối một gradient CsCl tuyến tính bằng cách sử dụng OptiMATE Gradient Maker so với phương pháp thủ công. Sơ đồ này không tính đến thời gian dành cho các phép tính số hoặc tạo phương pháp, vì đây là các hoạt động một lần. Người ta cũng giả định rằng các vật liệu khác (như ống) cần thiết cho thí nghiệm được giữ sẵn sàng để sử dụng. Mặc dù việc chuẩn bị một gradient tự hình thành CsCl không phải là một hoạt động tốn nhiều công sức, nhưng vẫn tiết kiệm được 2 phút thời gian (và 9 phút thời gian tiếp xúc) khi sử dụng OptiMATE Gradient Maker. Sự khác biệt này, mặc dù không đáng kể, có thể tăng lên khi tăng kích thước và số lượng ống (với nhiều hơn 2 ống, OptiMATE Gradient Maker sẽ phân phối và hàn kín song song).
OptiMATE Gradient Maker
Quy trình thủ công
Hình 3. Sơ đồ thiết lập gradient mật độ liên tục CsCl cho 2 ống Quick-Seal 13,5 mL (a) thủ công hoặc (b) sử dụng OptiMATE Gradient Maker. Các bước chuẩn bị được tô màu xám nhạt trong khi các bước chiết rót và đóng kín được tô màu xám đậm.
Kết quả
Cấu hình mật độ
Chất lượng của gradient được tạo sẵn sau khi phân phối có thể được quan sát trong biểu đồ gradient – một đồ thị biểu diễn mật độ so với thể tích tích lũy của các phân đoạn từ ống trước khi ly tâm (Hình 4). Ba ống phân phối khác nhau cho thấy sự chồng chéo mạnh mẽ về phân bố mật độ dọc theo chiều dài ống và gần khớp với gradient tuyến tính mục tiêu. Cần lưu ý rằng một phần thể tích ở đáy ống (mật độ gần 1,5 g/mL) không thể thu hồi được do những hạn chế của phương pháp thu hồi phân đoạn và do đó không được thể hiện ở đây. Các đường cong này chứng minh khả năng tái tạo và độ chính xác cao của quy trình phân phối bằng OptiMATE Gradient Maker.
Hình 4. So sánh các cấu hình gradient từ ba ống được phân phối bởi OptiMATE Gradient Maker.
Biểu đồ gradient mật độ cho các ống phân phối sau khi ly tâm được thể hiện trong Hình 5. Biểu đồ cho các gradient được tạo sẵn có sự chồng chéo tốt với các đường cong cho các gradient tự tạo sau khi chạy siêu ly tâm lên đến mật độ 1,4 g/mL cho cả hai kích thước ống (mặc dù có sự tách biệt lớn hơn giữa các đường cong nói chung đối với các ống 39 mL). Do đó, các gradient được tạo sẵn có thể giữ nguyên độ phân giải trong việc tách các capsid rỗng và đầy mặc dù chỉ có 20% thời gian ly tâm (4 giờ so với 20 giờ). Có thể lưu ý từ Hình 4 và 5 rằng vẫn có một số thay đổi đối với biểu đồ gradient mật độ giữa các ống gradient được tạo sẵn đã phân phối trước và sau siêu ly tâm. Điều này đặc biệt dẫn đến sự khác biệt trong biểu đồ gradient giữa gradient được tạo sẵn và gradient tự tạo về phía đáy ống. Điều này có thể không phải là mối quan tâm đối với quá trình tinh chế các capsid AAV đầy và rỗng nhưng có khả năng có thể được cải thiện bằng cách ly tâm các ống lâu hơn nếu cần. Ngoài ra, nhìn chung, độ dốc ít dốc hơn sau quá trình chạy 4 giờ có thể cho phép độ dốc được tạo sẵn duy trì độ phân giải tương đương hoặc tốt hơn so với độ dốc tự hình thành.
Tinh sạch AAV
Kết quả tinh sạch mẫu AAV theo cấu hình gradient được tạo sẵn và tự hình thành đã thiết lập này được thể hiện trong Hình 6 và Bảng 2.
Hình 5. So sánh biểu đồ gradient từ ống Quick-Seal 13,5 mL (trên) và ống Quick-Seal 39 mL (dưới). Cả hai biểu đồ đều có đường cong gradient mật độ CsCl được tạo sẵn bằng OptiMATE Gradient Maker, ly tâm trong 4 giờ (màu đỏ) so với gradient mật độ CsCl đồng nhất được phân phối thủ công, tự hình thành trong quá trình ly tâm 20 giờ (màu đen). Thanh sai số là độ lệch chuẩn. Các dải màu xanh lam và đỏ thể hiện phạm vi vị trí dự kiến của các dải capsid rỗng và đầy.
Hình 6. Hình ảnh các dải AAV sau khi siêu ly tâm từ các gradient mật độ tự hình thành chạy trong 20 giờ và các gradient mật độ được tạo sẵn chạy trong 5 giờ trong các ống 13,5 mL (trái) và ống 39 mL (phải).
Có sự khác biệt về cấu hình dải giữa các ống gradient mật độ tự hình thành và các ống gradient mật độ được tạo sẵn, đặc biệt là về độ lan tỏa (tức là độ sắc nét) của các dải capsid được lấp đầy một phần và đầy đủ, cũng như khoảng cách giữa các dải này và dải capsid rỗng. Tuy nhiên, mức độ tách biệt giữa dải capsid rỗng và dải capsid đầy đủ vẫn đủ để quan sát bằng mắt thường và thu hồi bằng cách chọc kim tiêm và chiết xuất. Vật liệu thu hồi này được kiểm tra độ tinh khiết bằng AUC (Hình 7). Các biểu đồ c(s) từ phân tích AUC đã được tích hợp để xác định tỷ lệ phần trăm capsid đầy đủ trong phân đoạn tinh khiết.
Dựa trên hiệu quả tinh chế toàn bộ capsid quan sát được từ Bảng 2 (> 90% đầy ở cả gradient mật độ đã tạo sẵn và tự hình thành), gradient mật độ được tạo sẵn có thể đạt được độ tinh khiết tương đương của capsid chứa đầy vg trong thời gian chạy siêu ly tâm ngắn hơn đáng kể là 5 giờ, tiết kiệm được 75% thời gian. Với việc tối ưu hóa gradient mật độ được tạo sẵn nhiều hơn, có thể đạt được khả năng phân tách trực quan tốt hơn giữa capsid rỗng, đầy một phần và đầy.
Phần kết luận
Một trong những điểm yếu mà thiết bị OptiMATE giải quyết với gradient tuyến tính là thời gian chạy siêu ly tâm. Gradient định hình sẵn cho phép rút ngắn thời gian chạy, cho phép tinh chế vật liệu nhanh hơn nhưng vẫn hiệu quả, vì gradient không còn phụ thuộc vào lực G để hình thành. Việc giảm thời gian chạy này có thể rút ngắn quy trình tinh chế từ 2-3 ngày xuống còn một ngày, tạo điều kiện thuận lợi cho việc mở rộng quy trình tinh chế. Ngoài ra, thời gian thiết lập được rút ngắn giúp giảm thiểu thời gian tiếp xúc của người vận hành, từ đó tăng hiệu suất tổng thể.
Nghiên cứu này đã chứng minh tính tương đương về độ tinh khiết của AAV chỉ trong một phần nhỏ thời gian sử dụng OptiMATE Gradient Maker. Tuy nhiên, người dùng được khuyến khích tự thực hiện các nghiên cứu tối ưu hóa của riêng mình và trong một số trường hợp, thời gian tiết kiệm được có thể lớn hơn với các phương pháp OptiMATE khác nhau, phù hợp với cấu hình phần cứng và vật tư tiêu hao riêng.
Hình 7. Biểu đồ C(s) của dữ liệu AUC của các phân đoạn capsid đầy đủ từ gradient mật độ được tạo sẵn (màu đỏ) và gradient mật độ tự hình thành (màu đen) không cho thấy bất kỳ đỉnh đáng kể nào đối với các hạt rỗng đối với cả ống 13,5 mL (trái) và ống 39 mL (phải).
| Kích thước ống (mL) | Vật mẫu | % Vỏ nang đầy đủ (theo AUC) |
|---|---|---|
| 13,5 | Mật độ gradient được tạo sẵn (5 giờ) | 91,21 ± 2,11% |
| Mật độ gradient được tạo sẵn (20 giờ) | 90,66 ± 2,54% | |
| 39 | Mật độ gradient được tạo sẵn (5 giờ) | 93,58% |
| Mật độ gradient được tạo sẵn (20 giờ) | 93,80% |
Bảng 2. Phân tích độ tinh khiết của AAV2 thu được sau khi ly tâm. Giá trị sai số được tính toán cho ống 13,5 mL với dữ liệu n=3, trong khi không có thanh sai số nào được tính toán cho ống 38 mL (n=1).
Những cân nhắc khi chuyển các giao thức CsCl thủ công hiện có sang OptiMATE Gradient Maker
- Lưu ý tỷ trọng của dung dịch CsCl đồng nhất được sử dụng trong quy trình hiện tại. Chạy quy trình CsCl hiện tại (có thể thay thế mẫu bằng dung dịch đệm) và thu thập các phần mẫu trong ống sau khi ly tâm. Xác định tỷ trọng của các phần mẫu. Có thể đo trực tiếp hoặc bằng cách đo chiết suất (RI) bằng máy đo khúc xạ và chuyển đổi sang tỷ trọng bằng công thức – Tỷ trọng = (RI – 1,2388)/0,0946) (trích từ các bảng tiêu chuẩn quốc tế).
- Vẽ đồ thị đường cong gradient sử dụng dữ liệu mật độ này để tìm ra giới hạn dưới và trên của gradient mật độ. Giới hạn trên của gradient mật độ có thể được ngoại suy bằng cách khớp phần tuyến tính của đường cong và lấy mật độ ở đáy ống, vì đường cong có xu hướng cong lên theo hướng phi tuyến tính về phía đáy ống. Có thể không cần phải khớp chính xác phần phi tuyến tính này.
- Chọn một giới hạn dưới và trên mục tiêu cho gradient được tạo sẵn sẽ được OptiMATE Gradient Maker tạo ra sao cho gần với giới hạn dưới và trên ước tính từ biểu đồ gradient của gradient tự tạo trong quy trình hiện tại. Cần đảm bảo rằng giới hạn dưới và trên mục tiêu này cách đều mật độ của dung dịch CsCl đồng nhất được sử dụng trong quy trình hiện tại. Nói cách khác, mật độ trung bình của gradient được tạo sẵn phải bằng mật độ của dung dịch CsCl đồng nhất được sử dụng trong quy trình hiện tại. Điều này cho phép các dải xuất hiện ở vị trí tương tự trong các ống nghiệm như trong quy trình CsCl hiện tại.
- Khi tạo phương pháp của OptiMATE Gradient Maker, hãy chọn phân phối tuyến tính và sử dụng giới hạn trên và dưới được chọn làm mật độ mục tiêu để tạo phương pháp.
- Nếu thành công, phương pháp này sẽ cho phép tạo ra các gradient CsCl được tạo sẵn, giúp thời gian ly tâm nhanh hơn.
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các dòng sản phẩm siêu ly tâm hãng Beckman Coulter.
EN