Thử nghiệm khả năng sống của tế bào phát quang và độc tính tế bào trên Máy đọc đĩa vi tấm đa chế độ SpectraMax i3x

Giới thiệu

Thiết bị đọc đĩa vi tấm đa chế độ SpectraMax i3x của Molecular Devices, kết hợp với các xét nghiệm phát quang để xác định khả năng sống của tế bào và độc tính tế bào, cung cấp một phương pháp nhạy và nhanh để đo số lượng tế bào sống trong nuôi cấy và định lượng các tác động gây độc tế bào của phương pháp điều trị thử nghiệm. Xét nghiệm CellTiter-Glo của Promega sử dụng enzyme luciferase, enzyme này cần ATP để tạo ra ánh sáng. Tín hiệu phát quang được tạo ra trong xét nghiệm phụ thuộc vào lượng ATP trong nuôi cấy, mà lượng ATP này lại phụ thuộc vào số lượng tế bào sống có mặt. Bộ xét nghiệm độc tính tế bào phát quang sinh học của BioVision dựa trên phép đo adenylate kinase (AK), một loại protein phổ biến có trong tất cả các tế bào và được giải phóng vào môi trường nuôi cấy khi màng tế bào mất tính toàn vẹn. AK chuyển đổi ADP thành ATP, sau đó được phát hiện thông qua phản ứng phát quang.

Nguyên vật liệu

• Xét nghiệm khả năng sống của tế bào phát quang CellTiter-Glo (Promega P/N G7570)
• Bộ xét nghiệm độc tính tế bào phát quang sinh học (BioVision P/N K312-500)
• Tế bào HeLa (ATCC P/N CCL-2)
• Đĩa nuôi cấy mô 96 giếng màu đen/trong suốt (Corning P/N 3904)
• Đĩa nuôi cấy mô trắng đặc 96 giếng (Corning P/N 3917)
• Đĩa nuôi cấy mô trắng đặc 384 giếng (Greiner P/N 781080)
• Máy đọc đĩa vi tấm đa chế độ SpectraMax i3x

Phương pháp

Chuẩn bị thuốc thử

Đệm CellTiter-Glo và chất nền đã được rã đông và cân bằng ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng. Hàm lượng của chai đệm CellTiter-Glo được chuyển vào chai màu hổ phách chứa chất nền CellTiter-Glo và nội dung được trộn bằng cách đảo nhẹ theo hướng dẫn trong bản tin kỹ thuật của bộ dụng cụ.

Đối với Bộ xét nghiệm độc tính tế bào phát quang sinh học , một lọ thuốc thử phát hiện AK được pha lại với 1,1 mL đệm xét nghiệm AK, trộn nhẹ nhàng và để cân bằng ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Thuốc thử AK Stock này sau đó được pha loãng gấp 10 lần vào đệm xét nghiệm để tạo thành dung dịch làm việc thuốc thử phát hiện AK.

Tương quan số lượng tế bào với tín hiệu phát quang

Tế bào HeLa được nuôi cấy trong MEM bổ sung 10% penicillin/streptomycin huyết thanh bò thai nhi. Các tế bào được trypsin hóa, treo trong môi trường nuôi cấy và đếm. Đối với định dạng xét nghiệm 96 giếng, các pha loãng tế bào nối tiếp từ 50.000 đến 10 tế bào trên mỗi giếng được mạ ở 100 µL huyền phù tế bào trên mỗi giếng. Đối với định dạng 384 giếng, các pha loãng tế bào nối tiếp từ 12.500 đến 6 tế bào trên mỗi giếng được mạ ở 25 µL trên mỗi giếng. Các giếng đối chứng chứa môi trường không có tế bào được chuẩn bị để thu được các giá trị phát quang nền.

Để đảm bảo số lượng tế bào chính xác cho các đường cong chuẩn tế bào, các tế bào được phân tích ngay lập tức. 100 µL (phân tích 96 giếng) hoặc 25 µL (phân tích 384 giếng) thuốc thử CellTiter-Glo được thêm vào mỗi giếng. Đĩa được trộn nhẹ nhàng trong 2 phút trên máy lắc đĩa và sau đó để ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút để ổn định độ phát quang.

Đường chuẩn ATP

Một loạt pha loãng ATP 1:10 được thiết lập trong các đĩa trắng đặc 96 và 384 giếng ở nồng độ từ 10 uM xuống 1 nM, cùng với các giếng trống không chứa tế bào. Xét nghiệm CellTiter-Glo được sử dụng để đo ATP. Tối ưu hóa vi đĩa và tối ưu hóa chiều cao đọc được thực hiện để có kết quả tốt nhất.

Xét nghiệm khả năng sống của tế bào và độc tính tế bào

Tế bào HeLa được nuôi cấy với mật độ 15.000 tế bào trên một giếng trong các vi đĩa nuôi cấy mô rắn màu trắng hoặc đáy trong 96 giếng và được để bám và phát triển qua đêm. Ngày hôm sau, staurosporine và anisomycin được thêm vào tế bào để gây apoptosis. Các hợp chất được thêm vào dưới dạng một loạt pha loãng 1:2 bắt đầu ở nồng độ cao nhất là 50 µM và giảm xuống còn 24 nM. Sau 24 giờ xử lý bằng các hợp chất, các tế bào được thử nghiệm bằng bộ dụng cụ CellTiter-Glo và BioVision Cytotoxicity.

Đối với xét nghiệm khả năng sống của tế bào, 100 µL thuốc thử CellTiter-Glo được thêm vào mỗi giếng của đĩa trắng rắn chứa các tế bào đã xử lý. Đĩa được đọc khoảng 10 phút sau khi thêm thuốc thử để cho phép tế bào bị phân hủy.

Đối với bộ xét nghiệm độc tính tế bào BioVision, 100 µL môi trường nuôi cấy được lấy ra khỏi mỗi giếng đã xử lý và chuyển vào một đĩa trắng đặc. 100 µL dung dịch làm việc thuốc thử AK được thêm vào mỗi giếng và đọc kết quả trên đĩa trong vòng 30 phút.

Thiết lập thiết bị và phân tích mẫu

Cài đặt đầu đọc SpectraMax i3x được cấu hình như chỉ ra trong Bảng 1.

Các phép tính RLU trung bình và độ lệch chuẩn, đồ thị của chuỗi pha loãng tế bào và đường chuẩn ATP, và đường phù hợp 4 tham số để tạo đường IC₅₀ được thực hiện bằng phần mềm SoftMax^® Pro. Một giao thức được cấu hình sẵn cho xét nghiệm CellTiterGlo được bao gồm trong thư viện giao thức của phần mềm.

*Định nghĩa đĩa vi tấm 384 giếng được tối ưu hóa bằng Trình hướng dẫn tối ưu hóa vi mạch trong Phần mềm SoftMax Pro.
**Chiều cao đọc được tối ưu hóa cho từng xét nghiệm bằng Trình hướng dẫn tối ưu hóa chiều cao đọc để đảm bảo phát hiện tín hiệu tối ưu.

Bảng 1. Cài đặt thiết bị để đo độ phát quang.

Kết quả

Máy đọc SpectraMax i3x có thể phát hiện ít nhất 10 tế bào trên mỗi giếng ở cả định dạng xét nghiệm 96 giếng và 384 giếng. Do đó, các tế bào có thể được đo ở số lượng dưới giới hạn phát hiện của phương pháp đo màu chuẩn và hầu hết các phương pháp đo huỳnh quang. Xét nghiệm CellTiter-Glo là tuyến tính trên toàn bộ phạm vi nồng độ tế bào được sử dụng, trải dài hơn ba cấp độ lớn với r² > 0,99 (Hình 1).

Hình 1. Đường chuẩn tế bào cho định dạng xét nghiệm 96 giếng (vòng tròn màu xanh) và 384 giếng (vòng tròn màu đỏ) được hiển thị. Ở mỗi định dạng, số lượng tế bào ít nhất là 10 tế bào trên mỗi giếng có thể được phát hiện. Đối với cả hai đường chuẩn, r² > 0,99.

Đường chuẩn ATP có thể được sử dụng để xác minh hiệu suất xét nghiệm và tính toán hàm lượng ATP của tế bào. Ở đây, tín hiệu phát quang từ các chuẩn ATP trong phạm vi từ 1 nM đến 10 uM bao phủ toàn bộ phạm vi đầu ra phát quang được quan sát thấy trong số lượng tế bào được xét nghiệm ở đây (Hình 2). Các phép đo là tuyến tính trong ít nhất bốn thập kỷ.

Hình 2. Đường chuẩn ATP cho định dạng xét nghiệm 96 giếng (vòng tròn màu đỏ) và 384 giếng (vòng tròn màu xanh lá cây) được hiển thị. Đối với cả hai đường chuẩn, r² = 0,999.

Các tế bào được xử lý bằng hợp chất staurosporine và anisomycin đã được thử nghiệm khả năng sống của tế bào bằng cách đo mức ATP (Hình 3) và độc tính tế bào bằng cách thử nghiệm enzyme adenylate kinase (Hình 4). Cả hai thử nghiệm đều mang lại giá trị IC₅₀ tương tự đối với staurosporine (lần lượt là 0,34 µM và 0,15 µM) và đối với anisomycin (3,30 µM và 2,28 µM).

Hình 3. Đường cong nồng độ-phản ứng đối với tế bào HeLa được xử lý bằng staurosporine (vòng tròn đỏ) và anisomycin (vòng tròn xanh lá cây) trong 24 giờ. Giá trị IC₅₀ đối với staurosporine là 0,34 µM, so với 3,30 µM đối với anisomycin.

Hình 4. Đường cong nồng độ-đáp ứng đối với tế bào HeLa được xử lý bằng staurosporine (vòng tròn đỏ) và anisomycin (vòng tròn xanh lá cây) trong 24 giờ. Các tế bào được thử nghiệm hoạt động của adenylate kinase bằng Bộ thử độc tính tế bào BioVision. Giá trị IC ₅₀ đối với staurosporine là 0,15 µM, so với 2,28 µM đối với anisomycin.

Kết luận

Máy đọc SpectraMax i3x cung cấp độ nhạy tối ưu trong việc phát hiện phát quang cho khả năng sống của tế bào dựa trên ATP và xét nghiệm độc tính tế bào dựa trên adenylate kinase, cho phép phát hiện ít nhất 10 tế bào trên mỗi giếng. Việc lắp đường cong bốn tham số và tính toán giá trị IC ₅₀ đều được thực hiện trong Phần mềm SoftMax Pro. Các trình hướng dẫn tối ưu hóa chiều cao đọc và vi đĩa đảm bảo phát hiện tín hiệu tối ưu và được phần mềm tự động hóa.

Ngoài phát hiện phát quang, máy đọc SpectraMax i3x cung cấp cho người dùng khả năng ghép kênh các xét nghiệm CellTiter-Glo và BioVision Cytotoxicity với các xét nghiệm khác yêu cầu các chế độ phát hiện bổ sung. Máy đọc đa chế độ này cung cấp khả năng phát hiện độ hấp thụ và phát hiện cường độ huỳnh quang với Spectral Fusion^™ Illumination đang chờ cấp bằng sáng chế để cung cấp tính linh hoạt của bước sóng trong khi tối đa hóa cường độ tín hiệu.

Khả năng thêm hộp mực có thể thay đổi được của người dùng, bao gồm huỳnh quang phân giải theo thời gian và phát hiện Western blot, và mô-đun Máy đo tế bào hình ảnh SpectraMax ^® MiniMax^™ 300 tùy chọn, mở rộng khả năng phát hiện của máy đọc và cho phép các tùy chọn ứng dụng vượt xa các tùy chọn của các máy đọc khác. Tất cả các cấu hình thiết bị đều được vận hành bằng Phần mềm SoftMax Pro, chứa các giao thức được cấu hình sẵn cho CellTiter-Glo và hơn 120 xét nghiệm khác để tạo điều kiện thuận lợi cho việc thu thập và phân tích dữ liệu.

Nguồn: https://www.moleculardevices.com/en/assets/app-note/br/luminescent-cell-viability-and-cytotoxicity-assays-on-spectramax-i3x-multi-mode-microplate

Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các Máy đọc đĩa vi tấm hãng Molecular Devices.