T-series TFF cassettes với màng 100 kDa Delta: Giải pháp lọc tiếp tuyến hiệu quả cho RNA & LNP

Vật liệu và phương pháp

Nhóm tác giả đã đánh giá hai cassette TFF chứa màng cellulose tái sinh 100 kDa trong nghiên cứu này, như mô tả trong Bảng 1. Các thực hành tốt nhất trong xử lý mRNA được duy trì trong suốt quá trình thử nghiệm, và tất cả vật tư tiêu hao cũng như dung dịch đệm sử dụng đều không chứa RNase. Toàn bộ các thử nghiệm được thực hiện với hệ thống TFF ở chế độ tuần hoàn dòng. Theo khuyến nghị từ nhà cung cấp cassette, nhóm tác giả đã thực hiện bước làm sạch bằng NaOH với nồng độ 0,25 N (Delta) và 1,0 N (cassette màng Sartocon Slice 200 Hydrosart, Sartorius) trong 1 giờ cho toàn bộ đường dòng của hệ thống TFF. Nhóm tác giả sử dụng một hệ thống TFF bao gồm bơm nhu động, ống dẫn đường kính trong 1/8” (cho bơm và van đầu ra) và 1/16” (cho đường thẩm thấu), cảm biến áp suất (đầu vào, đầu ra và thẩm thấu), và cân điện tử (cho dòng đầu vào và thẩm thấu). Áp suất xuyên màng (TMP) được kiểm soát bằng van tạo áp ngược ở dòng đầu ra. Lưu lượng thẩm thấu được đo theo khối lượng trong vòng 1 phút và chuẩn hóa theo diện tích bề mặt để tính toán thông lượng (flux). Nhiệt độ của quá trình UF/DF được duy trì ở mức 20°C ± 2°C. Tất cả các thông số vận hành và kết quả (ví dụ: lưu lượng dòng, tải lượng) đều được chuẩn hóa theo diện tích lọc hiệu dụng (EFA) nhằm đảm bảo điều kiện vận hành tương đương giữa các cassette.

Bảng 1. Đánh giá đặc điểm của TFF cassettes 

Kết quả và thảo luận

RNA thông tin (mRNA)

Tác giả sử dụng một cấu trúc mRNA mã hóa cho protein huỳnh quang xanh (GFP) (~1 kb, chưa gắn mũ, có đuôi PolyA dài khoảng 120 nucleotide) cho quá trình thử nghiệm. Hỗn hợp mRNA thô được dùng làm nguyên liệu đầu vào. Khi khảo sát thông lượng thẩm thấu ban đầu với nguyên liệu mRNA ở ba tốc độ dòng đầu vào khác nhau — 2,5; 5,0 và 7,5 L/phút/m² (LMM) — kết quả cho thấy cassette Delta cho thông lượng cao hơn (Hình 2A) so với cassette màng Hydrosart (Hình 2B) ở mọi tốc độ dòng. Thông lượng thẩm thấu giới hạn tại tốc độ dòng đầu vào cao nhất (7,5 LMM) đạt mức cao hơn 1,9 lần đối với cassette Delta (315 LMH) so với cassette màng Hydrosart (163 LMH, Hình 2C).

Hình 2. Biến động thông lượng với mRNA thô. Đường biểu diễn thông lượng thẩm thấu (L/m²/h, LMH) so với áp suất xuyên màng (TMP) cho cassette màng Delta (A) và Hydrosart (B) ở ba tốc độ dòng đầu vào khác nhau. (C) So sánh thông lượng thẩm thấu giới hạn tại tốc độ dòng đầu vào 7,5 LMM. Nồng độ mRNA đầu vào khoảng ~0,5 g/L và tải lượng là 5 L/m². Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (S.D.), n = 3. Giá trị p: *** < 0.001. Phân tích thống kê được thực hiện bằng kiểm định t của Student (không ghép cặp, hai phía)

Sử dụng chiến lược kiểm soát áp suất xuyên màng (TMP), tác giả đã tiến hành lọc trao đổi (diafiltration) ở tốc độ dòng đầu vào 7,5 LMM trong năm thể tích trao đổi (diavolumes – DV). Quá trình diafiltration được thực hiện gần mức TMP giới hạn cho cả hai loại cassette màng Delta và Hydrosart (15 đến 20 psi [1,03 đến 1,38 bar, 0,10 đến 0,14 MPa]). Cassette màng Delta cho thông lượng cao hơn trong quá trình diafiltration (Hình 3A), dẫn đến thời gian xử lý nhanh hơn khoảng 40% đến 50% so với cassette màng Hydrosart. Lợi thế về thông lượng này có thể chuyển thành giảm thời gian xử lý hoặc giảm diện tích màng lọc cần thiết trong quy trình sản xuất.

Độ thấm nước chuẩn hóa (NWP) của cả hai cassette không thay đổi đáng kể sau quá trình diafiltration, cho thấy hiện tượng tắc nghẽn màng là thấp (Hình 3B). Tác giả không ghi nhận sự khác biệt đáng kể về hiệu suất thu hồi hoặc độ toàn vẹn của mRNA giữa cassette Delta và Hydrosart (Hình 3C và 3D). Với cassette màng Delta, độ toàn vẹn của mRNA (phân tích bằng phương pháp điện di gel mao quản, thiết bị PA800 Plus, SCIEX) cho thấy diện tích đỉnh chính > 90%, không có sự khác biệt đáng kể giữa mẫu đầu vào và mẫu giữ lại sau quá trình diafiltration ở nhiệt độ phòng (Hình 3C). Hiệu suất thu hồi mRNA (dựa trên nồng độ đo bằng bộ kit Ribogreen) sau diafiltration trung bình đạt 94% (Hình 3D). Mức giữ lại sản phẩm của cả hai cassette Delta và Hydrosart đều trên 99,3%, do nồng độ mRNA trong phần thẩm thấu thấp hơn giới hạn định lượng (BLQ) của phương pháp Ribogreen. Nồng độ protein (đo bằng bộ kit NanoOrange) trong cả mẫu mRNA thô và mẫu sau lọc đều dưới giới hạn định lượng đối với cả hai loại cassette, do đó không thể đưa ra kết luận về khả năng loại bỏ tạp protein.

Hình 3. Quá trình lọc trao đổi (diafiltration) mRNA thô. (A) So sánh thông lượng giữa cassette màng Delta và Hydrosart trong quá trình diafiltration mRNA thô. (B) Độ thấm nước chuẩn hóa (NWP) ở 20°C trước và sau quá trình diafiltration (DF). (C) Độ toàn vẹn của mRNA (diện tích đỉnh chính) trong mẫu đầu vào và mẫu giữ lại sau lọc. (D) Tỷ lệ thu hồi sản phẩm trong mẫu giữ lại sau quá trình diafiltration. Nồng độ mRNA đầu vào khoảng ~0,5 g/L và được nạp với tải lượng 5 L/m². Ba cassette độc lập (n = 3) được sử dụng cho mỗi loại cassette. Dung dịch đệm dùng trong diafiltration: 10 mM TRIS và 1 mM EDTA, pH 7.5. Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (S.D.), n = 3. Giá trị p: ns = không có ý nghĩa thống kê (p > 0.05). Phân tích thống kê được thực hiện bằng kiểm định t của Student (không ghép cặp, hai phía).

RNA tự khuếch đại (saRNA)

Đối với hỗn hợp thô của saRNA (cấu trúc GFP, dài 8,5 kb, chưa gắn mũ, có đuôi PolyA khoảng 40 nucleotide), kết quả khảo sát thông lượng thẩm thấu cho thấy cassette màng Delta có hiệu suất thông lượng cao hơn (Hình 4A) ở ba tốc độ dòng đầu vào khác nhau so với cassette màng Hydrosart (Hình 4B). Ở tốc độ dòng đầu vào cao nhất (7,5 LMM), thông lượng thẩm thấu giới hạn của cassette Delta (161 LMH) cao hơn 1,8 lần so với cassette Hydrosart (91 LMH, Hình 4C). Điều đáng chú ý là tác giả quan sát thấy kích thước của cấu trúc RNA có ảnh hưởng đến thông lượng thẩm thấu qua các cassette TFF, trong đó thông lượng giới hạn giảm khi kích thước RNA tăng từ 1 kb lên 8,5 kb với nồng độ RNA tương đương (so sánh Hình 2C và 4C).

Hình 4. Biến thiên thông lượng với saRNA. Đường cong biểu diễn thông lượng thẩm thấu so với áp suất xuyên màng (TMP) cho cassette màng Delta (A) và Hydrosart (B) ở ba tốc độ dòng đầu vào khác nhau. (C): So sánh thông lượng giới hạn giữa cassette màng Delta và Hydrosart tại tốc độ dòng đầu vào 7,5 LMM. Nồng độ saRNA đầu vào khoảng ~0,5 g/L và tải lượng 5 L/m². Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (S.D.), n = 3. Giá trị p: ** p < 0.01. Phân tích thống kê được thực hiện bằng kiểm định t của Student (không ghép cặp, hai phía).

Quá trình lọc trao đổi được thực hiện tại tốc độ dòng đầu vào 7,5 LMM và TMP giới hạn (20 psi [1,37 bar, 0,137 MPa] cho cassette màng Delta; 13 psi [0,89 bar, 0,089 MPa] cho cassette màng Hydrosart) với saRNA cho thấy cassette Delta duy trì thông lượng thẩm thấu cao hơn một cách ổn định trong suốt 5 thể tích trao đổi (Hình 5A), đồng thời rút ngắn thời gian xử lý khoảng 40% so với cassette Hydrosart. Độ thấm nước chuẩn hóa (NWP) không thay đổi đáng kể sau quá trình diafiltration đối với cả hai loại cassette (Hình 5B), cho thấy hiện tượng tắc nghẽn màng là thấp. Điều kiện xử lý DF không ảnh hưởng đến chất lượng của saRNA, thể hiện qua độ toàn vẹn > 95% và không có sự khác biệt đáng kể giữa mẫu đầu vào và mẫu giữ lại đối với cả hai loại cassette (Hình 5C). Hiệu suất thu hồi từ cassette màng Delta trung bình đạt 87% sau DF và không có sự khác biệt thống kê so với cassette màng Hydrosart (Hình 5D).

Hình 5. Quá trình lọc trao đổi saRNA. (A) Quá trình diafiltration của saRNA thô thể hiện sự khác biệt về thông lượng trong suốt 5 thể tích trao đổi giữa cassette màng Delta và Hydrosart. (B) Độ thấm nước chuẩn hóa (NWP) ở 20°C trước và sau quá trình diafiltration. (C) Độ toàn vẹn của saRNA (diện tích đỉnh chính) trong mẫu đầu vào và mẫu giữ lại sau lọc. (D) Tỷ lệ thu hồi sản phẩm từ mẫu giữ lại sau quá trình diafiltration. Nồng độ saRNA đầu vào khoảng ~0,5 g/L và tải lượng là 5 L/m². Ba cassette độc lập (n = 3) được sử dụng cho mỗi loại cassette. Dung dịch đệm dùng trong diafiltration: 10 mM TRIS và 1 mM EDTA, pH 7.5. Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (S.D.), n = 3. Giá trị p: ns – không có ý nghĩa thống kê (p > 0.05). Phân tích thống kê được thực hiện bằng kiểm định t của Student (không ghép cặp, hai phía).

Hạt nano lipid (LNP)

RNA đã được đóng mũ enzym (enzymatically capped RNA) được bao gói vào các hạt nano lipid (LNPs) với thành phần lipid tùy chỉnh bao gồm cholesterol cùng các loại lipid ion hóa được, lipid hỗ trợ và lipid ổn định, sử dụng hệ thống tạo hạt nano Nanoassemblr™ Blaze™. Hỗn hợp lipid trong ethanol được trộn với RNA (trong dung dịch 0,1 M natri axetat, pH 4.0) theo tỷ lệ 1:3 (lipid : RNA), sau đó được pha loãng bằng dung dịch PBS 1× (pH 7.4). Để khảo sát ảnh hưởng của hóa học màng lọc đến hiệu suất lọc trao đổi tangential flow filtration (TFF) với RNA-LNPs, các thử nghiệm biến động thông lượng thẩm thấu ban đầu được thực hiện sử dụng cassette màng Omega™ và Delta có kích thước lọc 100 kDa, lần lượt chứa màng polyethersulfone (PES) và cellulose tái sinh (RC). Cassette màng PES thể hiện hiện tượng tắc nghẽn màng nặng với thông lượng dưới 20 LMH và không phụ thuộc vào tốc độ dòng đầu vào hay áp suất xuyên màng (TMP) (Hình 6A), trong khi màng RC cho thông lượng lên đến 157 LMH (Hình 6B) ở tốc độ dòng đầu vào 7 LMM. Dựa trên những quan sát ban đầu này, các cassette màng RC đã được chọn để nghiên cứu tiếp theo.

Hình 6. Các đường cong biến động thông lượng (flux excursion) của RNA-LNPs sử dụng cassette màng Omega™ (polyethersulfone) 100 kDa (A) và Delta (cellulose tái sinh) 100 kDa (B) ở ba tốc độ dòng đầu vào khác nhau.

Sau đó, RNA-LNPs mới được sử dụng để chạy thử nghiệm biến động thông lượng trên các cassette màng Delta và Hydrosart với ba lần lặp lại. Đường cong biểu diễn thông lượng thẩm thấu so với áp suất xuyên màng (TMP) cho thấy màng Delta có thông lượng cao hơn so với màng Hydrosart trong tất cả các điều kiện thử nghiệm (Hình 7A và 7B). Ở tốc độ dòng đầu vào 7,5 LMM, tác giả quan sát thấy cassette màng Delta có thông lượng giới hạn cao hơn 1,8 lần (161 LMH) so với cassette màng Hydrosart (91 LMH) (Hình 7C).

Hình 7. Biến động thông lượng với mRNA-LNPs. Các đường cong thông lượng thấm qua so với áp suất xuyên màng (TMP) cho cassette màng Delta (A) và Hydrosart (B) ở ba tốc độ dòng đầu vào khác nhau. (C) So sánh thông lượng thấm giới hạn tại tốc độ dòng đầu vào 7,5 LMM. Ba cassette độc lập (n = 3) được sử dụng cho mỗi loại cassette. Dữ liệu được biểu thị dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (S.D.), n = 3. ** p < 0,01. Phân tích thống kê sử dụng kiểm định t của Student (không ghép cặp, hai phía).

Sau khi đóng gói, tác giả đã xử lý dung dịch RNA-LNP qua quá trình UF/DF để đạt được nồng độ RNA mong muốn, loại bỏ ethanol và trao đổi đệm sang dung dịch đệm cuối cùng. Quá trình cô đặc 8 lần và diafiltration 6 thể tích trao đổi được thực hiện ở tốc độ dòng đầu vào 7,5 LMM và áp suất xuyên màng tới hạn (cassette màng Delta 20 psi; cassette màng Hydrosart 18 psi). Ở tải lượng tương tự (34 L/m² cho cassette Delta, 28 L/m² cho cassette Hydrosart), quá trình UF/DF trung bình mất 40 phút với cassette Hydrosart trong khi cassette Delta nhanh hơn 41%, trung bình chỉ mất 24 phút (Hình 8A).

Độ thấm nước chuẩn hóa (NWP) không thay đổi đáng kể sau UF/DF đối với cả hai loại cassette (Hình 8B), cho thấy mức độ tắc màng thấp. Độ toàn vẹn của mRNA trong LNPs lớn hơn 93% và không có sự khác biệt thống kê giữa mẫu đầu vào và mẫu giữ lại đối với cả cassette Delta và Hydrosart (Hình 8C). Tỷ lệ thu hồi mRNA-LNPs sau UF/DF đạt 70% đến 80%, không khác biệt đáng kể giữa hai loại cassette (Hình 8D). Hiệu quả bao gói mRNA lớn hơn 95% cho cả hai loại cassette sau UF/DF (Hình 8E). Tỷ lệ giữ lại sản phẩm vượt quá 99,7% đối với cả hai loại cassette. Sau khi thực hiện lọc tiệt trùng, các dung dịch mRNA-LNP được pha loãng theo chuỗi và ủ với tế bào HEK293, sau đó đo biểu hiện GFP bằng phương pháp flow cytometry. Đường cong đáp ứng liều được thể hiện trong Hình 8F. Không có sự khác biệt đáng kể về giá trị EC50 (nồng độ LNPs cho đáp ứng tối đa một nửa) (p > 0,05) giữa LNPs xử lý bằng cassette Delta (0,04 ± 0,02 μg/mL) và Hydrosart (0,02 ± 0,01 μg/mL).

Hình 8. Hiệu suất UF/DF với mRNA-LNPs. (A) Tác giả thực hiện quá trình cô đặc và diafiltration của RNA-LNPs với dung dịch đệm diafiltration gồm 20 mM TRIS và 10% sucrose (pH 7.4). Tải lượng cho cassette màng Delta là 34 L/m² và cho cassette màng Hydrosart là 28 L/m². Đường cong thông lượng thấm qua theo thời gian được trình bày cho cả cassette Delta và Hydrosart, mỗi loại được thử nghiệm ba lần (B) Độ thấm nước chuẩn hóa (NWP) ở 20°C trước và sau quá trình UF/DF. (C) Độ toàn vẹn của mRNA (diện tích đỉnh chính) trong LNPs từ mẫu đầu vào và mẫu giữ lại. (D) Tỷ lệ thu hồi sản phẩm từ mẫu giữ lại sau UF/DF. (E) Hiệu suất bao gói mRNA trong mẫu giữ lại sau UF/DF. (F) Đường cong đáp ứng liều của tế bào HEK293 biểu hiện GFP với mRNA-LNPs đã được điều chế. Các đường cong được khớp dựa trên phân tích tổng bình phương sai số còn lại sử dụng phương trình Hill. Ba cassette độc lập (n = 3) được sử dụng cho mỗi loại cassette; dữ liệu biểu thị trung bình ± độ lệch chuẩn (S.D.), n = 3. Giá trị p: ns = không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Phân tích thống kê được thực hiện bằng kiểm định t của Student (không ghép cặp, hai phía).

Ví dụ về phát triển quy trình

Các đường cong thông lượng thấm qua (như những hình minh họa trong Hình 2, 4, 6 và 7) thường được sử dụng trong quá trình tối ưu hóa quy trình để chọn các tham số đầu vào như hóa chất màng lọc, MWCO, tốc độ dòng cấp, và áp suất xuyên màng (TMP). Nếu hệ số cô đặc thể tích (VCF) mong muốn và số lần diafiltration (DV) để trao đổi đệm đã được xác định, bước tiếp theo thường là chạy quy trình ở quy mô bàn thí nghiệm và ghi lại thông lượng thấm theo thời gian (tương tự dữ liệu trong Hình 3A, 5A, và 8A). Việc tính trung bình thông lượng thấm ghi nhận theo thời gian (Jave) cung cấp tất cả các dữ liệu cần thiết để ước tính tải trọng thích hợp cho quy trình của bạn và diện tích màng lọc cần thiết để mở rộng quy mô sản xuất:

Trong đó, A là diện tích màng lọc cần thiết, VB là thể tích mẻ (batch volume) cần xử lý, và t là thời gian xử lý mong muốn cho mẻ đó (không bao gồm thời gian xả màng hoặc các bước thu hồi thêm).

Lấy ví dụ quy trình LNP trong Hình 8 — quy trình bao gồm cô đặc 8 lần, diafiltration 6 lần DV, và thí nghiệm ở quy mô bàn thí nghiệm cho kết quả Jave là 126 LMH. Để xử lý một mẻ LNP giả định có thể tích 250 L trong vòng 2 giờ, sẽ cần diện tích màng lọc ít nhất 1.6 m² với tải trọng ≤ 155 L/m².

Các cassette dòng T-series sử dụng màng Delta 100 kDa có nhiều kích thước diện tích lọc khác nhau, phù hợp cho phát triển quy trình ở quy mô bàn thí nghiệm, quy mô thử nghiệm, và sản xuất quy mô lớn (xem Bảng 2). Những cassette này cũng có thể được xếp chồng để tạo ra diện tích lọc giữa các kích thước cassette hoặc lớn hơn 2.5 m² cho sản xuất mẻ lớn.

Bảng 2. Kích thước cassette T-series với màng Delta 100 kDa

Kết luận

Dữ liệu trên chứng minh hiệu quả của cassette màng TFF Delta 100 kDa trong việc xử lý mRNA, saRNA và LNP. Trong tất cả các quy trình, tác giả không quan sát thấy sự khác biệt đáng kể về Độ thấm nước chuẩn hóa (NWP) sau quá trình diafiltration (DF) hoặc kết hợp UF/DF, cho thấy mức độ đóng màng thấp. Cũng không có sự khác biệt đáng kể nào về độ nguyên vẹn của mRNA trong tất cả các quy trình thử nghiệm, cho thấy các cassette này không gây ra lực cắt quá mức đối với các cấu trúc RNA này. Hiệu suất thu hồi từng bước cho cassette màng Delta đạt trung bình từ 80% đến 94% trên các cấu trúc RNA được thử nghiệm. Cuối cùng, đối với ba cấu trúc RNA được thử nghiệm, giới hạn dòng thấm (limiting flux) của Delta cao hơn 1,8 đến 1,9 lần so với cassette màng cellulose tái sinh 100 kDa tương tự (Sartocon Hydrosart E screen). Dòng thấm giới hạn cao hơn này giúp rút ngắn thời gian xử lý trong tất cả các quy trình đánh giá, có thể giúp sản xuất nhanh hơn hoặc tiết kiệm chi phí hơn nhờ sử dụng diện tích màng TFF nhỏ hơn cho cùng một kích thước mẻ sản xuất.

Nguồn: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/Solutions/Bioprocessing/Knowledge-center/TFF-membranes-for-RNA-and-LNP-applications?srsltid=AfmBOopWvgHBZSUTC-R92Up_2DW97YzR686AlLLZT-sv3AtL7-b43hHp

Minh Khang là nhà nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp Thiết bị lọc hãng Cytiva.