Tổng quan
Bộ kit mRNA cho tế bào T GenVoy-ILM™ là hỗn hợp thuốc thử hạt nano lipid (LNP) được tối ưu hóa để đưa mRNA hoặc mRNA CRISPR Cas9 với gRNA vào tế bào T nguyên phát của con người bằng cách sử dụng LNP được chuẩn bị trên hệ thống NanoAssemblr™ Spark™ và Ignite™.
Bộ kit mRNA cho tế bào T GenVoy-ILM™ mang lại những lợi ích sau:
- Loại bỏ và biểu hiện gen hiệu quả cao: mRNA hoặc mRNA/sgRNA có thể được đưa vào tế bào T nguyên phát của con người đã hoạt hóa một cách nhất quán với hiệu quả loại bỏ gen cao.
- Khả năng sống của tế bào cao: Duy trì khả năng sống của tế bào T cao, ngay cả sau khi biến đổi gen tuần tự.
- Có thể mở rộng: Mở rộng nghiên cứu liệu pháp tế bào của bạn trên nền tảng NanoAssemblr™ từ giai đoạn khám phá đến tiền lâm sàng.
- Được xác thực với quy trình sản xuất tế bào T: Được tối ưu hóa và xác thực cho quy trình nuôi cấy tế bào T tiếp theo.
Các bộ dụng cụ này cho phép các nhà nghiên cứu thiết lập một phương pháp có liên quan về mặt lâm sàng và có thể mở rộng để cung cấp gen ex vivo và chỉnh sửa gen để thúc đẩy sự phát triển của liệu pháp tế bào T. Các bộ dụng cụ này có thể được sử dụng ở nhiều giai đoạn khác nhau của nghiên cứu và phát triển liệu pháp tế bào từ giai đoạn khám phá đến tiền lâm sàng trên các nền tảng NanoAssemblr™.
Tỷ lệ tế bào T được thiết kế cao hơn so với phương pháp điện chuyển nạp (EP)
Sử dụng GenVoy-ILM™ để đưa mRNA vào tế bào T nguyên phát của con người được kích hoạt dẫn đến tăng số lượng tế bào T được thiết kế. Phương pháp này chứng minh phương pháp đưa gen hiệu quả hơn so với EP.
Hiệu suất chuyển nạp được đo lường thông qua biểu hiện protein bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy tại thời điểm 24 và 48 giờ sau xử lý. Phương pháp điện chuyển nạp (EP) được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất, trong khi xử lý bằng hạt nano lipid (LNP) được thực hiện theo quy trình sử dụng bộ kit GenVoy-ILM™ T cell cho mRNA trên thiết bị Spark™. Các tế bào không xử lý (UT) được dùng làm đối chứng. **p<0.01, **p<0.0001, phân tích bằng phép kiểm ANOVA một chiều (one-way ANOVA).
Biểu hiện protein tế bào đồng nhất
Việc thiết kế tế bào T nguyên phát của con người bằng Bộ kit mRNA cho tế bào T GenVoy-ILM™ mang lại sự biểu hiện protein cực kỳ đồng đều trên toàn bộ quần thể tế bào được xử lý.
Biểu đồ cường độ huỳnh quang trung bình (MFI) đại diện cho biểu hiện protein bề mặt tế bào được tạo ra bằng cách sử dụng đếm tế bào dòng chảy tại thời điểm 24 và 48 giờ sau xử lý. EP được thực hiện theo giao thức của nhà sản xuất. Các tế bào chưa được xử lý (UT) được sử dụng làm đối chứng.
Tế bào T có khả năng sống cao
Tế bào T nguyên phát của con người được kích hoạt vẫn có khả năng sống cao sau khi đưa gen ex vivo bằng Bộ kit mRNA cho tế bào T GenVoy-ILM™
Khả năng sống của tế bào được đo bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy tại thời điểm 24 và 48 giờ sau xử lý. EP được thực hiện theo giao thức của nhà sản xuất và điều trị LNP được thực hiện theo Bộ kit mRNA cho tế bào trên giao thức Spark™. Các tế bào chưa được xử lý (UT) được sử dụng làm đối chứng. ****p < 0,0001 theo ANOVA một chiều.
Kỹ thuật nhiều bước của tế bào T cho liệu pháp tế bào có sẵn
Đạt được hiệu quả cao trong việc chỉnh sửa bộ gen kết hợp với mức độ biểu hiện CAR CD19 cao. Điều này cho phép thiết kế các tế bào CAR T “phổ quát” có chức năng và khả thi có thể tiêu diệt hiệu quả các tế bào khối u CD19+.
A) Minh họa sơ đồ thí nghiệm. mRNA-LNP chứa sgRNA + mRNA Cas9 được thêm vào tế bào T nguyên phát. Các tế bào được mở rộng trước khi xử lý bằng mRNA-LNP CD19 CAR. Sau 24 giờ xử lý bằng mRNA-LNP CAR, xét nghiệm tiêu diệt tế bào T CD19+ được tiến hành trong 16 giờ. B) Hiệu quả loại bỏ tế bào TCR được đánh giá. Mẫu ban đầu là mẫu TCR âm tính được chọn để tinh chế thêm quần thể TCR-. C) Trái: Tỷ lệ biểu hiện CAR CD19 24 giờ sau khi xử lý bằng mRNA-LNP CAR ở mức 3,2 μg RNA/triệu tế bào, khi quần thể là TCR+ hoặc TCR−. Phải: Khả năng sống của tế bào tương ứng, được chuẩn hóa theo quần thể chưa xử lý. D) Tiêu diệt chức năng tế bào B CD19+ (SUP-B15) bằng tế bào T UT, TCR+/CAR+ hoặc TCR−/CAR+ đã chỉnh sửa gen theo tỷ lệ tác nhân/mục tiêu đã chỉ định (E:T). Đối với tất cả, liều lượng 3,2 μg RNA/triệu tế bào đã được áp dụng. Thanh sai biểu thị độ lệch chuẩn. Ý nghĩa thống kê được đánh giá bằng cách sử dụng kiểm định t hoặc ANOVA một chiều trong số các nhóm được hiển thị (2).
Mở rộng quy mô từ khám phá đến tiền lâm sàng
Dữ liệu chứng minh rằng Bộ kit mRNA cho tế bào T GenVoy-ILM™ và nền tảng NanoAssemblr™ có khả năng mở rộng cho phép hiệu suất mạnh mẽ và tương đương trên cả thiết bị Spark™ và Ignite™, cho phép mở rộng quy mô từ phát hiện đến tiền lâm sàng.
A) GFP và B) Hiệu quả chuyển gen CAR CD19 24 giờ sau khi bổ sung mRNA-LNP. C) Mức độ loại bỏ mục tiêu đơn (thụ thể tế bào T, TCR) và D) Loại bỏ mục tiêu kép (TCR và CD52) thông qua việc cung cấp mRNA sgRNA và Cas9. E) Tiêu diệt chức năng tế bào B CD19+ (SUP-B15) trong thí nghiệm nuôi cấy chung kéo dài 16 giờ. Đối với tất cả: liều 3,2 μg RNA/triệu tế bào được áp dụng cho tế bào T nguyên phát của người. RNA-LNP được chuẩn bị theo GenVoy-ILM™ trên hướng dẫn sử dụng Spark™ hoặc Ignite™. Biểu hiện gen trung bình và loại bỏ gen được phát hiện bằng phương pháp đo lưu lượng tế bào cho thấy tối thiểu n=8 chế phẩm RNA-LNP độc lập và n=2 người hiến tặng. Hiệu suất tiêu diệt chức năng được phát hiện bằng phương pháp đo lưu lượng tế bào cho thấy n=2 chế phẩm RNA-LNP độc lập và n=2 người hiến tặng. Thanh sai biểu thị độ lệch chuẩn có ý nghĩa thống kê được đánh giá bằng kiểm định t trong các nhóm được chọn (2).
Các thành phần của bộ dụng cụ
| GenVoy-ILM™ T cell Kit for mRNA, Spark™, (Part no. 1000700) | GenVoy-ILM™ T cell Kit for mRNA w/ 5 Spark™ cartridge, (Part no. 1000683) | GenVoy-ILM™ T cell Kit for mRNA, Ignite™, 3 mL, (Part no. 1001144) | GenVoy-ILM™ T cell Kit for mRNA, Ignite™, 6 mL, (Part no. 1001161) | |
|---|---|---|---|---|
| Lipid mix | 90 µL | 90 µL | 3 mL | 6 mL |
| Formulation buffer (10X) | 30 µL | 30 µL | 2 mL | 4 mL |
| Dilution buffer (10X) | 900 µL | 900 µL | 40 mL | 80 mL |
| Cryopreservation buffer (2X) | – | – | 3 mL | 6 mL |
| Apolipoprotein-E (ApoE) | 50 µg | 50 µg | 500 µg | 500 µg x 2 |
| Spark Cartridges | – | 5 | – | – |
EN