Giới thiệu
Các phương pháp phát hiện vi sinh dựa trên tăng trưởng tự động được sử dụng để phát hiện nhanh ô nhiễm vi sinh trong các sản phẩm dược phẩm như liệu pháp tế bào và gen (Cell and Gene Therapy – CGT). Đối với những liệu pháp nằm trên hành trình điều trị quan trọng cho bệnh nhân, mỗi ngày hoặc mỗi giờ tiết kiệm được trong quá trình kiểm nghiệm sản phẩm trước khi xuất xưởng đều vô cùng quan trọng, góp phần tăng tốc đưa thuốc đến tay bệnh nhân cần điều trị.
Giải pháp BACT/ALERT® 3D (BTA) cung cấp một phương pháp phát hiện vi sinh nhanh dựa trên tăng trưởng, tự động và không phá hủy mẫu, và hiện được xem là phương pháp tham chiếu theo Dược điển châu Âu (EP) chương 2.6.27 và Dược điển Hoa Kỳ (USP) chương <72>. Mặc dù hầu hết các vi sinh vật có liên quan có thể được phát hiện trong vòng chưa đầy 72 giờ, nhưng trong thực tế, thời gian ủ mẫu hiện nay vẫn kéo dài 7 ngày trước khi xuất xưởng sản phẩm. Nguyên nhân chủ yếu là do nguy cơ nhiễm các vi sinh vật phát triển chậm như nấm mốc, Cutibacterium acnes hoặc Micrococcus luteus. Để nâng cao khả năng phát hiện các chủng vi sinh vật phát triển chậm này, nhóm nghiên cứu đã đánh giá nhiều loại môi trường nuôi cấy, các yếu tố tăng trưởng và điều kiện ủ khác nhau. Dựa theo hướng dẫn từ chương <72> của USP, thời gian ủ tối thiểu đã được xác định và so sánh với quy trình hiện hành.
Mục đích nghiên cứu
Trình bày dữ liệu chứng minh rằng việc tối ưu hóa điều kiện ủ và bổ sung môi trường nuôi cấy BACT/ALERT® có thể cải thiện đáng kể thời gian phát hiện vi sinh vật, phù hợp với cập nhật mới trong chương USP <72>, từ đó rút ngắn thời gian kiểm nghiệm vi sinh và đẩy nhanh quá trình xuất xưởng sản phẩm CGT.
Vật liệu và phương pháp
BACT/ALERT® 3D DUAL-T
- Phương pháp phát hiện vi sinh dựa trên tăng trưởng/hô hấp, dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu khí, yếm khí và nấm bằng cách kết hợp giữa lọ nuôi cấy hiếu khí và yếm khí theo yêu cầu của các Dược điển.
- Phát hiện sự hiện diện của vi sinh vật dựa trên việc tạo ra khí CO₂ hòa tan, được theo dõi liên tục nhờ cảm biến màu và hệ thống đo ánh sáng phản xạ.
Hình 1. A/ Hệ thống BACT/ALERT® 3D DUAL-T; B/ Lọ môi trường nuôi cấy dùng trong công nghiệp; C/ Nguyên lý phát hiện; D/ Cảm biến đo màu chỉ thị kết quả dương tính
Tổng quan nghiên cứu
- 11 chủng vi sinh vật đã được cấy vào các lọ tiêu chuẩn của BACT/ALERT® dùng trong công nghiệp (lọ iAST để kiểm tra vi khuẩn hiếu khí, lọ iLYM được tối ưu cho nấm men và nấm mốc, lọ iNST dùng cho kiểm tra vi khuẩn yếm khí), hoặc vào các lọ có bổ sung chất hỗ trợ mà không chứa sản phẩm (Bảng 1).
- Các lọ không được cấy vi sinh vật được dùng làm đối chứng âm tính.
- Khi áp dụng, việc bổ sung bao gồm các dung dịch yếu tố tăng trưởng (tham khảo 5–8) được chuẩn bị nội bộ (Bảng 2), hoặc sản phẩm bổ sung thương mại có sẵn (BD BBL™ IsoVitaleX™) nhằm thúc đẩy sự phát triển của các vi sinh vật khó nuôi cấy.
- Ít nhất 3 lọ được cấy với nồng độ thấp (≤ 10 CFU/lọ), với nguồn vi sinh được chuẩn bị từ môi trường nuôi cấy tươi hoặc BIOBALL®, sau đó được ủ ở các mức nhiệt 22°C, 32°C hoặc 36°C.
- Thời gian phát hiện trung bình (MTTD) của mỗi vi sinh vật được so sánh giữa các điều kiện thử nghiệm khác nhau.
- “Biên độ an toàn” được tính theo hướng dẫn của USP <72>, dựa trên đường cong tăng trưởng trên đĩa thạch để xác định thời gian thế hệ của vi sinh vật phát triển chậm nhất.
Bảng 1: Danh sách các vi sinh vật và điều kiện ủ được đánh giá
Bảng 2: Danh sách các yếu tố tăng trưởng được đánh giá so với sản phẩm bổ sung thương mại có sẵn
Kết quả
Hình 2 (trái): Thời gian phát hiện trung bình (tính bằng ngày) của các vi sinh vật hiếu khí sử dụng chai môi trường hiếu khí iAST ở 22,5°C, iAST ở 32,5°C và chai hiếu khí chuyên biệt cho nấm iLYM ở 22,5°C (n = 10).
Hình 3 (phải): Thời gian phát hiện trung bình (tính bằng ngày) của các vi sinh vật kỵ khí sử dụng chai iNST ở 32,5°C, iNST ở 36°C, iNST + chất bổ sung thương mại ở 32,5°C và iNST + chất bổ sung thương mại ở 36°C (n = 3 đến 5, ngoại trừ C. sporogenes, C. acnes và S. aureus trong iNST 32,5°C, với n = 10).
Các đường cong tăng trưởng của C. acnes dựa trên việc đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch đã được tạo ra cho cả 4 điều kiện (dữ liệu không hiển thị), bắt đầu từ một môi trường nuôi cấy tươi và được sử dụng để xác định: Thời gian thế hệ (generation time), Biên độ an toàn (safety margin), và Thời gian ủ cần áp dụng theo USP <72> (incubation time to be applied according to USP <72>).
Bảng 3: Tính toán thời gian ủ theo USP <72> trong các điều kiện ủ khác nhau cho C. acnes
Thảo luận
- Khi sử dụng kết hợp chai iAST 22,5°C và iNST 32,5°C, tất cả các chủng vi sinh vật được cấy với lượng ≤ 10 CFU (trong điều kiện không có sản phẩm) đều được phát hiện trong vòng 7 ngày (Hình 2 và 3).
- Việc bổ sung chai nuôi cấy hiếu khí thứ ba ở 32,5°C giúp rút ngắn thời gian phát hiện trung bình (MTTD) của một số vi khuẩn hiếu khí như M. luteus (dưới 3 ngày thay vì 5 ngày) (Hình 2).
- Như được mô tả bởi Daane & Jeffrey(3), MTTD của nấm mốc có thể được tối ưu hóa hơn nữa bằng cách sử dụng chai iLYM: A. brasiliensis được phát hiện ở 22,5°C trong chưa đầy 3 ngày (Hình 2). Việc ủ ở nhiệt độ thấp là yếu tố then chốt để phục hồi các chủng phân lập từ môi trường như Aspergillus spp. hoặc Penicillium spp.
- C. acnes phát triển tối ưu ở nhiệt độ cơ thể người. Việc ủ ở 36°C cho thấy có sự cải thiện rõ rệt trong MTTD (rút ngắn khoảng 1 ngày) đối với C. acnes (Hình 3), đồng thời cũng có lợi cho B. fragilis và P. vulgatus (Hình 3).
- Các yếu tố tăng trưởng bổ sung được mô tả trong tài liệu(4–7) cũng được sàng lọc và so sánh với chế phẩm bổ sung thương mại (Bảng 2). Một số thành phần như sắt nitrat (0,25 g/L), NAD (0,25 g/L) có ảnh hưởng hạn chế đến sự phát triển của C. acnes. Ngược lại, BSA (10% v/v) lại có tác động tiêu cực(8). Trái với báo cáo của Kumaran & Ramirez-Arcos(7), việc bổ sung Tween 80 không mang lại cải thiện đáng kể (đã lặp lại kết quả, dữ liệu không được hiển thị). Các axit amin chứa lưu huỳnh có tác động tích cực đến tốc độ phát triển của C. acnes(6), đôi khi cho kết quả tương đương với chế phẩm thương mại, nhưng không vượt trội hay kém hơn.
- Chế phẩm bổ sung thương mại cũng được đánh giá với tất cả các chủng vi sinh vật kỵ khí (Hình 3). Kết quả cho thấy tác động tích cực hoặc trung tính đến MTTD, giúp cải thiện MTTD khoảng gần 1 ngày ở 32,5°C và gần 2 ngày ở 36°C.
- Cuối cùng, việc xác định thời gian thế hệ của C. acnes (Bảng 3) — vẫn là chủng phát triển chậm nhất trong số các vi sinh vật được thử nghiệm — đã chứng minh rằng việc tăng nhiệt độ và bổ sung tăng trưởng giúp cải thiện đáng kể sự phát triển của C. acnes, từ đó tối ưu hóa thời gian an toàn để giải phóng sản phẩm CGT.
- Khi áp dụng biên độ an toàn theo hướng dẫn của USP <72>, dữ liệu cho thấy thời gian ủ có thể được rút ngắn một cách đáng kể, từ 7 ngày còn chưa đến 4 ngày trong điều kiện không có sản phẩm.
Kết luận
Hệ thống BACT/ALERT® 3D DUAL-T tự động, dựa trên phương pháp phát hiện tăng trưởng, vẫn là tiêu chuẩn vàng cho việc kiểm tra độ vô trùng của các sản phẩm liệu pháp tế bào và gen (CGT). Trong bối cảnh của USP <72>, dữ liệu được trình bày cung cấp cơ hội để tối ưu hóa bằng cách sử dụng các điều kiện: iLYM 22,5°C, iAST 32,5°C và iNST + chất bổ sung ở 36°C, từ đó giúp rút ngắn đáng kể thời gian giải phóng sản phẩm CGT — đặc biệt đối với vi sinh vật phát triển chậm nhất là C. acnes. Khi áp dụng các hướng dẫn của USP <72>, dữ liệu (trong điều kiện không có sản phẩm) cho thấy rằng thời gian ủ hiện tại là 7 ngày có thể được rút ngắn 3 ngày một cách an toàn, giúp các liệu pháp CGT được đưa đến tay bệnh nhân nhanh hơn.
Lời cảm ơn
Các tác giả xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Lori Daane vì những đóng góp đáng kể từ các nghiên cứu trước đây đã hỗ trợ quan trọng cho kết quả của nghiên cứu này. Đồng thời, trân trọng cảm ơn nhóm Nghiên cứu & Phát triển (R&D), đặc biệt là Anne Hutchins và Sophie Valery, vì sự hỗ trợ liên tục và giúp đỡ tận tình trong quá trình thực hiện các thử nghiệm.
Minh Khang là nhà phân phối độc quyền các sản phẩm kiểm tra vi sinh vật hãng bioMérieux (Pháp).
EN