Lợi ích
- Phát hiện biểu hiện luciferase firefly và Renilla trong 20 tế bào hoặc ít hơn trên mỗi giếng
- Cải thiện độ chính xác của kết quả bằng cách chuẩn hóa biểu hiện của gen báo cáo với một đối chứng.
- Xem kết quả nhanh hơn với phần mềm phân tích dữ liệu và biểu đồ SoftMax Pro
Giới thiệu
Cathy Olsen, Tiến sĩ | Nhà khoa học ứng dụng cấp cao | Thiết bị phân tử
Firefly luciferase là một gen báo cáo được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu chức năng và điều hòa gen. Đây là loại rất nhạy do không có bất kỳ hoạt động luciferase nội sinh nào trong tế bào hoặc mô động vật có vú. Firefly luciferase là protein 62-kDa hoạt động dưới dạng monomer và không yêu cầu quá trình xử lý sau để thực hiện chức năng của nó. Nó xúc tác quá trình oxy hóa D-luciferin phụ thuộc ATP với sự phát xạ ánh sáng kết quả (Hình 1A). Luciferase chiết xuất từ sinh vật biển Renilla reniformis thường được sử dụng trong các xét nghiệm luciferase ghép kênh như một gen báo cáo thứ hai để chuẩn hóa hiệu quả chuyển gen và để nghiên cứu chức năng và điều hòa gen. Renilla luciferase xúc tác quá trình oxy hóa coelenterazine bằng oxy để tạo ra ánh sáng (Hình 1B).
Một bộ thuốc thử đồng nhất (Hệ thống xét nghiệm Luciferase Dual-Glo®) cho phép đo cả hoạt động của firefly luciferase và Renilla trong một mẫu duy nhất, với firefly đóng vai trò là gen báo cáo thử nghiệm và Renilla là chất kiểm soát. Ở đây, xét nghiệm được thiết lập với các mẫu tế bào được chuyển gen để đánh giá hiệu suất và độ nhạy của xét nghiệm. Cả hai phản ứng luciferase đều dễ dàng được đo trên Máy đọc đĩa vi tấm đa năng SpectraMax® Mini của Molecular Devices, với phân tích dữ liệu tỷ lệ được thực hiện bằng Phần mềm SoftMax Pro®.
Nguyên vật liệu
- Hệ thống xét nghiệm Dual-Glo® Luciferase (Promega cat. #E2920)
- Tế bào HeLa (ATCC cat. #CCL-2)
- vectơ biểu hiện firefly luciferase pGL4.13[luc2/SV40] (Promega cat. #E668A)
- pGL4.75[hRluc/CMV] Vectơ biểu hiện Renilla luciferase (Promega cat. #E693A)
- Thuốc thử chuyển gen ViaFect ™ (Promega cat. #E4981)
- Opti-MEM Reduced Serum Medium (ThermoFisher Scientific cat. #31985062)
- Đệm ly giải thụ động (Promega cat. #1941)
- Đĩa vi tấm 96 giếng màu trắng đặc (mã Greiner #655075)
- Máy đọc đĩa vi tấm đa năng SpectraMax Mini (Thiết bị phân tử)
- Khối lọc phát quang (Thiết bị phân tử P/N 5089334)
Xét nghiệm luciferase kép dựa trên tế bào
Chuyển gen tế bào
Tế bào HeLa được nuôi cấy với mật độ 2×105 tế bào trên một giếng trong các đĩa nuôi cấy mô 6 giếng đã xử lý và ủ ở 37°C/5% CO2 trong 24 giờ trước khi chuyển gen. Vectơ biểu hiện firefly luciferase pGL4.13[luc2/SV40] được pha loãng trong môi trường Opti-MEM thành 1 μg/μL, và vectơ biểu hiện luciferase Renilla pGL4.75[hRluc/CMV] được pha loãng thành 100 ng/μL. Ba ống nghiệm được thiết lập như sau và hòa trộn: 400 μL môi trường Opti-MEM + 2 μL (2 μg) vectơ biểu hiện luciferase đom đóm pGL4.13[luc2/SV40] + 2 μL (2 ng) vectơ biểu hiện luciferase Renilla pGL4.75[hRluc/CMV]. Mỗi ống được thêm 6 μL thuốc thử ViaFect và hòa trộn đều. Các ống được ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng để tạo phức hợp. Nhỏ từng giọt 200 μL phức hợp chuyển gen vào mỗi giếng của đĩa 6 giếng, vừa nhỏ vừa xoay nhẹ để hòa trộn đều.
Các tế bào được ủ ở 37°C/5% CO2 trong 48 giờ sau khi chuyển gen và sau đó được thu hoạch để xét nghiệm.
Chuẩn bị mẫu tế bào
Các mẫu tế bào phù hợp để thử nghiệm hiệu suất của thiết bị được chuẩn bị như sau. Các tế bào được chuyển gen trong đĩa 6 giếng được xử lý bằng trypsin, đếm và chia thành các phần nhỏ chứa khoảng 60.000 tế bào mỗi phần. Sau đó, các tế bào được quay ở tốc độ 1500 vòng/phút trong 5 phút và rửa một lần bằng PBS. PBS được loại bỏ và các viên tế bào được bảo quản ở -80°C cho đến thời điểm thử nghiệm.
Để tạo ra các dịch ly giải tế bào đại diện cho số lượng tế bào được chuyển gen đã biết, một phần nhỏ tế bào đông lạnh được rã đông đến nhiệt độ phòng và ly giải bằng cách thêm 150 μL đệm ly giải thụ động và nhẹ nhàng hút lên xuống, sau đó ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng để đảm bảo ly giải hoàn toàn. Các dịch ly giải được pha loãng với 450 μL môi trường nuôi cấy tế bào để thu được mẫu chứa khoảng 105 tế bào/mL. Từ dịch ly giải này, một loạt các pha loãng 1:2 được thực hiện trong môi trường.
Thiết lập thử nghiệm
75 μL của mỗi dung dịch pha loãng của dịch ly giải tế bào, đại diện cho khoảng 15 đến 7500 tế bào trên mỗi giếng, được hút vào các giếng ba lần của một đĩa trắng 96 giếng. Một bộ bản sao chỉ chứa môi trường hoặc đệm được đưa vào làm mẫu trắng.
75 μL thuốc thử Dual-Glo Luciferase được thêm vào mỗi giếng xét nghiệm; ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, sau đó đo độ phát quang của firefly trên máy đọc đĩa SpectraMax Mini với thời gian tích hợp 0,5 giây. Sau đó, thêm 75 μL thuốc thử Dual-Glo Stop & Glo vào các giếng xét nghiệm, ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, sau đó đo độ phát quang của Renilla trên máy đọc đĩa SpectraMax Mini với thời gian tích hợp 0,5 giây.
Phần mềm SoftMax® Pro được sử dụng để phân tích và biểu đồ hóa dữ liệu. Độ phát quang được đo (đơn vị ánh sáng tương đối, RLU) đối với firefly luciferase tong mỗi mẫu được chia cho phép đo Renilla tương ứng để tính tín hiệu chuẩn hóa.
Dữ liệu đại diện
Hình 2 cho thấy các sơ đồ đại diện cho firefly luciferase và Renilla được phát hiện trong các tế bào HeLa được chuyển gen. Những kết quả này chỉ ra rằng cả hai luciferase đều có thể được phát hiện trong ít hơn 20 tế bào trên mỗi giếng bằng cách sử dụng xét nghiệm Dual-Glo. Việc chuẩn hóa hoạt động của firefly luciferase thành hoạt động của Renilla (Hình 3) giúp hiệu chỉnh các giá trị gia tăng trong thử nghiệm như số lượng tế bào và hiệu quả chuyển gen báo cáo từ giếng này sang giếng khác. Máy đọc đĩa
SpectraMax® Mini
SpectraMax Mini cung cấp độ nhạy phát quang cho phép nhiều quy trình làm việc thử nghiệm khác nhau để dễ dàng phát hiện các kết quả xét nghiệm luciferase, với khả năng phân tích dữ liệu dễ dàng bằng Phần mềm SoftMax Pro.
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các Máy đọc đĩa vi tấm hãng Molecular Devices
EN