Giới thiệu
Các mô hình sinh học 3D phức tạp như organoid và spheroid có nguồn gốc từ bệnh nhân đang ngày càng phổ biến trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu y sinh vì chúng tái hiện chặt chẽ hơn các mô trong cơ thể sống. Các mô hình 3D này có tiềm năng to lớn trong mô hình hóa bệnh, sàng lọc thuốc, nghiên cứu độc tính, tương tác giữa vật chủ và vi khuẩn và y học chính xác.1 Để sử dụng organoid cho sàng lọc quy mô lớn, tự động hóa đóng vai trò quan trọng trong việc xử lý lượng mẫu lớn và nuôi cấy các dòng iPSC nhất quán và có khả năng tái tạo hơn cũng như các organoid có nguồn gốc từ chúng.
Yêu cầu chính của hệ thống nuôi cấy tự động là khả năng theo dõi các mô sống. Các tế bào làm việc được trang bị tự động hóa như cánh tay rô-bốt để tiếp cận các máy ủ và máy chụp ảnh có thể được sử dụng để chụp ảnh thường xuyên nhằm theo dõi các tế bào. Các số liệu định lượng thu được từ các hình ảnh biểu diễn sự hợp lưu nuôi cấy tế bào, kích thước khuẩn lạc iPSC và kích thước và hình dạng của organoid có thể được sử dụng làm thước đo quyết định để kích hoạt quy trình cuối tự động như truyền tế bào hoặc tiến hành xét nghiệm điểm cuối hoặc được sử dụng để kiểm soát chất lượng.
Để theo dõi tế bào, chụp ảnh trường sáng là lựa chọn phổ biến do tính đơn giản và độc tính ánh sáng thấp hơn so với chụp ảnh huỳnh quang. Tuy nhiên, ảnh trường sáng có xu hướng có độ tương phản thấp, nền cao hoặc không đồng nhất và hiệu ứng cạnh. Những vấn đề này có thể cản trở khả năng phân đoạn hình ảnh mạnh mẽ để phân tích.
Học máy hoặc trí tuệ nhân tạo (AI) đề cập đến một tập hợp các thuật toán tính toán có thể xác định các mẫu trong dữ liệu hiện có có hoặc không có sự can thiệp của con người. Sau đó, các thuật toán học máy sẽ tự động suy ra các quy tắc để phân biệt các lớp.4
Học sâu là một dạng học máy sử dụng mạng nơ-ron nhân tạo (ANN) để tìm hiểu mối quan hệ đầu vào/đầu ra. ANN là các mô hình toán học được biểu diễn bằng nhiều lớp “nơ-ron” hoặc ô tính toán.5
Việc áp dụng trí tuệ nhân tạo (AI) trong phân tích hình ảnh gần đây đang nhanh chóng phát triển mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu. Học sâu, một trong những loại AI, đã được sử dụng thành công trong các ứng dụng hình ảnh y tế, bệnh lý và sinh học.2 Trong phân tích hình ảnh sinh học, học sâu có thể được sử dụng để tăng cường hình ảnh thô để phân đoạn hình ảnh và theo dõi đối tượng. Phân tích hình ảnh thông thường thường liên quan đến việc xác định một tập hợp các tham số cố định để phân đoạn các đối tượng quan tâm để định lượng ở quy trình cuối. Tuy nhiên, các tham số được xác định trước này không hiệu quả đối với tất cả các thí nghiệm do tính biến động cao trong các điều kiện thí nghiệm. Việc điều chỉnh thủ công giao thức phân tích là không thực tế do khối lượng dữ liệu hình ảnh quá lớn trong môi trường thông lượng cao.
Để vượt qua những thách thức này, Molecular Devices đã sử dụng các công cụ AI để phân đoạn hình ảnh (SINAP) và phân loại đối tượng để tự động hóa các phân tích hình ảnh của các khuẩn lạc iPSC, organoids và spheroids. Phần mềm phân tích hình ảnh IN Carta® cung cấp giao diện người dùng trực quan bao gồm các công cụ AI trong quy trình phân tích hình ảnh. SINAP dựa trên học sâu cho phép phát hiện mạnh mẽ các đối tượng phức tạp cần quan tâm (ví dụ như khuẩn lạc tế bào gốc hoặc cơ quan) với sự can thiệp tối thiểu của con người. Đầu ra phân tích bao gồm các phép đo hình thái, cường độ và kết cấu. Phân loại dữ liệu cũng có thể được sử dụng với hình tượng dựa trên học máy. Molecular Devices chứng minh tính khả thi của việc sử dụng phát hiện đối tượng dựa trên AI và đặc điểm kiểu hình cho ba mô hình tế bào phức tạp: mở rộng iPSC, phát triển cơ quan phổi 3D và tác dụng của thuốc chống ung thư lên khối u. Những kết quả này hỗ trợ việc tích hợp các phương pháp phân tích hình ảnh học sâu vào bất kỳ quy trình tự động hóa nội dung cao nào sẽ tạo điều kiện thuận lợi đáng kể cho việc tạo ra iPSC và cơ quan chất lượng cao trên quy mô lớn cho các ứng dụng ở quy trình cuối
Vật liệu và phương pháp
Thu thập và phân tích hình ảnh
Tất cả hình ảnh đều được chụp bằng Hệ thống chụp ảnh nội dung cao Micro Confocal ImageXpress® (Thiết bị phân tử) sử dụng Phần mềm phân tích và thu thập hình ảnh nội dung cao MetaXpress®. Vì các khuẩn lạc iPSC tương đối phẳng và ít có độ tương phản trong trường sáng, nên hình ảnh được chụp với độ lệch khoảng 100 µm để tăng độ tương phản ở rìa của các khuẩn lạc. Đối với các cơ quan phổi, hình ảnh chồng Z được chụp bằng vật kính 4X với lựa chọn chiếu “tiêu điểm tốt nhất”. Đối với spheroids, hình ảnh xếp chồng Z được thực hiện bằng vật kính 10X với lựa chọn chiếu “tiêu điểm tốt nhất”.
Phần mềm IN Carta được sử dụng cho tất cả các phân tích. Chức năng “xuất sang IN Carta” trong phần mềm MetaXpress được sử dụng để nhập hình ảnh vào phần mềm IN Carta. SINAP được sử dụng để thực hiện phân đoạn tất cả các hình ảnh. Mỗi mô hình được đào tạo và xác minh trước khi được sử dụng trong giao thức phân tích. Sau khi phân tích, công cụ phân loại được sử dụng để tạo các nhóm dựa trên các phép đo cụ thể. Đối với các tập dữ liệu phức tạp hơn, các biểu tượng hình ảnh dựa trên máy học được sử dụng để tạo các lớp biểu hiện hình thái.
Nuôi cấy tế bào
Organoids phổi: Các cơ quan phổi 3D có nguồn gốc từ các tế bào biểu mô phổi nguyên phát của người (ScienCell). Các tế bào được nuôi cấy và nhân rộng trong 2D theo giao thức ScienCell. Đối với nuôi cấy cơ quan 3D, Bộ dụng cụ PneumaCult ™ Airway Organoid (STEMCELL Technologies) được sử dụng theo giao thức của nhà sản xuất. Tóm lại, các tế bào được gieo trong các vòm Matrigel 90% (Corning) theo định dạng đĩa 24 giếng (1 vòm cho mỗi giếng) và được nuôi cách ngày trong hai tuần bằng môi trường gieo hạt PneumaCult Airway Organoid. Quá trình biệt hóa được thực hiện thêm sáu tuần nữa bằng môi trường biệt hóa PneumaCult Airway Organoid.
Nuôi cấy iPSC: Tế bào iPSC của người thích nghi với điều kiện không có chất nuôi cấy (SC102A-1, System Biosciences) được rã đông và nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy Complete mTeSRTM Plus (STEMCELL Technologies) trong các đĩa phủ Matrigel (mục #354277, Corning). Môi trường được thay đổi mỗi ngày, ngoại trừ một lần mỗi tuần khi thêm gấp đôi thể tích môi trường để bỏ qua việc thay đổi môi trường trong một ngày. Tế bào được nuôi cấy bằng thuốc thử không có enzyme ReLeSR™ (STEMCELL Technologies) theo tỷ lệ phân chia 1:6–1:10.
Nuôi cấy Spheroid: Spheroid được hình thành từ các tế bào TU-BcX4IC có nguồn gốc từ khối u nguyên phát. Các tế bào này được phân loại là ung thư vú chuyển sản với phân nhóm TNBC. Các tế bào TU-BcX-4IC được gieo từ 2000 đến 4000 tế bào trên mỗi giếng trong đĩa ULA 384 giếng (Corning) và ủ trong 72 giờ. Sau đó, Spheroid được xử lý bằng hợp chất và theo dõi vào ngày 1, ngày 3 và ngày 5.
Kết quả
Mô hình dựa trên học sâu để phân đoạn hình ảnh
Phân tích hình ảnh tự động là một phần không thể thiếu của hầu hết các hệ thống hình ảnh tự động. Khả năng theo dõi tế bào và organoid theo thời gian thực và trích xuất thông tin có ý nghĩa phụ thuộc vào khả năng phân tích hình ảnh mạnh mẽ của hình ảnh ánh sáng truyền không cần chất đánh dấu. Những thách thức liên quan đến việc phân tích hình ảnh trường sáng bao gồm độ tương phản thấp, nền cao và hiện tượng nhiễu hình ảnh (Hình 1A). Một tập hợp các tham số toàn cục được xác định khó thành công trong việc phân đoạn các đối tượng được chụp trong trường sáng. Những tiến bộ gần đây trong học máy đang cải thiện quy trình làm việc phân tích hình ảnh và cho phép phân đoạn hình ảnh mạnh mẽ hơn trong các tập dữ liệu phức tạp. Ở đây, Molecular Devices trình bày cách các mô hình học sâu có thể được sử dụng để phân tích nhiều mô hình sinh học khác nhau như trong sinh học tế bào gốc, organoid 3D và hình cầu.
Hình 1. Vượt qua những thách thức trong phân đoạn hình ảnh với các mô hình dựa trên học máy. A) Ví dụ về các mô hình sinh học khác nhau được trình bày là thách thức đối với phân tích định lượng. Các spheroids 3D được nuôi cấy trong các vi tấm tạo ra bóng đổ xung quanh mỗi tấm gây trở ngại cho việc phân đoạn đối tượng (mũi tên). Organoids 3D được nuôi cấy trong Matrigel thường tạo ra nền không đồng nhất do sự biến dạng từ Matrigel và từ các đối tượng nằm ngoài mặt phẳng hình ảnh (box). iPSC phát triển dưới dạng nuôi cấy tương đối phẳng, do đó, độ tương phản thấp (mũi tên màu xanh) và mảnh vụn (mũi tên màu vàng) cản trở việc phân đoạn hình ảnh mạnh mẽ của các khuẩn lạc iPSC. B) Tổng quan về quy trình đào tạo mô hình. C) Các bước chính để tạo mô hình trong phần mềm IN Carta bằng SINAP với các hình ảnh ví dụ được hiển thị. Hình ảnh được chú thích bằng các công cụ đánh dấu để chỉ ra các đối tượng quan tâm và nền. Hình ảnh có chú thích, đại diện cho hệ thống cơ bản, được thêm vào bộ dữ liệu. Trong bước đào tạo, một mô hình được tạo dựa trên mô hình hiện có phù hợp nhất và các chú thích do người dùng chỉ định. Trong ví dụ được hiển thị, cần phải hiệu chỉnh mask phân đoạn (bước 3), lặp lại các bước 1–3.
Theo dõi sự phát triển của nuôi cấy iPSC theo thời gian
Nuôi cấy iPSC đòi hỏi phải bổ sung chất hàng ngày và kiểm tra trực quan thường xuyên hình thái tế bào để kiểm tra sự biệt hóa tự phát. Vì quá trình nuôi cấy được xác định bởi kích thước và sự phân bố của khuẩn lạc, nên việc theo dõi sự phát triển của các nuôi cấy iPSC là rất quan trọng. Ở đây, kích thước của từng khuẩn lạc iPSC được theo dõi trong sáu ngày nuôi cấy bằng cách sử dụng hình ảnh trường sáng và phân đoạn hình ảnh dựa trên máy học để phân tích (Hình 2).
Hình 2. Mô hình dựa trên học sâu được sử dụng để phân đoạn các khuẩn lạc iPSC và theo dõi sự phát triển. A) Hình ảnh ví dụ cho thấy sự phát triển của iPSC trong nuôi cấy trong bốn ngày. Lớp phủ màu hồng được hiển thị là mask phân đoạn khi sử dụng SINAP. Khoảng 12 hình ảnh đã được chú thích và sử dụng để đào tạo mô hình học sâu trong SINAP. B) Công cụ phân loại trong phần mềm IN Carta được sử dụng để phân loại các đối tượng đã phân đoạn dựa trên các phép đo và cổng do người dùng lựa chọn. Tại đây, các đối tượng được phân loại thành các lớp nhỏ, trung bình và lớn theo diện tích của chúng. C) Biểu đồ cho thấy sự phân bố kích thước khuẩn lạc iPSC theo thời gian. Như mong đợi, tần suất các khuẩn lạc iPSC lớn tăng theo thời gian trong nuôi cấy. D) Sự thay đổi về diện tích và đường kính khuẩn lạc iPSC trung bình theo thời gian trong nuôi cấy (các giá trị chuẩn hóa).
Phân tích organoids 3D phổi
Các organoid 3D là những mô hình mạnh mẽ với nhiều ứng dụng y sinh. Vì chúng có thể được lấy từ bất kỳ bệnh nhân nào, các organoid có tiềm năng to lớn trong việc khám phá thuốc và trong liệu pháp cá nhân hóa. Các organoid có thể được nuôi cấy trong nhiều tháng, do đó khả năng theo dõi trạng thái của organoid là công cụ để kiểm soát chất lượng và nghiên cứu theo dõi thời gian.
Molecular Devices trình bày một ví dụ về các cơ quan phổi được nuôi cấy và chụp ảnh trong Matrigel theo thời gian trong trường sáng (Hình 3). Các phép đo như diện tích, đường kính, hệ số hình dạng, kết cấu và cường độ có thể được sử dụng để theo dõi sự phát triển và biệt hóa của cơ quan.
Hình 3. Áp dụng phương pháp dựa trên AI để đánh giá sự phát triển của các cơ quan phổi. A) Hình ảnh của các cơ quan phổi được nuôi cấy trong mái vòm Matrigel. Những hình ảnh này thường có nền cao, không đồng nhất, ngăn cản việc phân đoạn đối tượng mạnh mẽ bằng các phương pháp phân tích hình ảnh thông thường. Sử dụng SINAP, một mô hình đã được tạo ra để phân đoạn các cơ quan phổi (mặt nạ được hiển thị trong lớp phủ màu). B) Đồ thị cho thấy sự thay đổi về đường kính và diện tích phổi trung bình trong 2, 3 và 4 tuần nuôi cấy (các thanh lỗi được chuẩn hóa biểu thị độ lệch chuẩn giữa các giếng sao chép).
Phân đoạn và phân loại phương pháp điều trị hợp chất các spheroids khối u có nguồn gốc từ bệnh nhân
Các spheroids u được tạo ra từ bệnh nhân có thể được sử dụng trong y học chính xác và phát hiện thuốc để xác định các hợp chất điều trị. Các tế bào lấy từ một khối u ban đầu mang đột biến ung thư vú triple negative đã được nuôi cấy và điều trị với các hợp chất chống ung thư. Các tác động của việc điều trị các spheroids đã được theo dõi theo thời gian (Hình 4). Thêm vào đó, dựa trên các hình ảnh sáng trường, nhiều kiểu hình spheroid khác nhau có thể được quan sát. Trong khi các spheroids không được điều trị thể hiện cấu trúc chặt chẽ với các cạnh rõ ràng, thì các spheroids đã được điều trị thể hiện các cạnh không rõ ràng và “lan tỏa” ở mức độ khác nhau. Phần mềm IN Carta® Phenoglyphs là một công cụ phân loại dựa trên học máy và có thể được sử dụng để xác định các nhóm kiểu hình dựa trên hình thái học spheroid, cường độ và kết cấu. Chúng tôi đề xuất rằng phương pháp này có thể được sử dụng để nhanh chóng xác định tác động của các hợp chất trong các thử nghiệm sàng lọc trong tương lai
Hình 4. Phân tích hình thái của phương pháp điều trị hợp chất trên spheroids từ bệnh nhân theo thời gian. A) Các hình cầu được theo dõi bằng hình ảnh trường sáng vào ngày 1, 3 và 5 sau khi điều trị. Hình ảnh được phân đoạn bằng SINAP trong phần mềm IN Carta (lớp phủ màu đỏ tươi). B) Mô-đun phần mềm Phenoglyphs IN Carta được sử dụng để phát hiện các kiểu hình khác nhau. Các spheroids đối chứng không được xử lý cho thấy các tế bào được đóng gói chặt chẽ với các cạnh được xác định trong khi các hình cầu được xử lý cho thấy nhiều kiểu hình khác nhau. Các cạnh của các hình cầu được xử lý ít được xác định hơn, có một cạnh khuếch tán và các tế bào được đóng gói lỏng lẻo.
Kết luận
- Phương pháp sử dụng AI để phân tích hình ảnh và tập dữ liệu phức tạp mang lại kết quả mạnh mẽ cho quy trình xử lý hình ảnh có nội dung cao.
- SINAP là một công cụ thân thiện với người dùng để tạo các mô hình học sâu tùy chỉnh nhằm phân đoạn mạnh mẽ các mô hình sinh học không cần chất đánh dấu
- Phenoglyphs cho phép lập hồ sơ kiểu hình dựa trên máy học trực quan có thể áp dụng cho các tập dữ liệu phức tạp như spheroids lấy từ bệnh nhân.
- SINAP và biểu tượng hình ảnh là các công cụ AI bổ sung cho nhau trong phần mềm IN Carta, cung cấp giải pháp toàn diện, thu hẹp khoảng cách giữa các câu hỏi sinh học phức tạp và câu trả lời do AI thúc đẩy.
Tài liệu tham khảo
- Clevers H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 2016;165(7):1586–97.
- Meijering E. A bird’s-eye view of deep learning in bioimage analysis. Comput Struct Biotechnol J. 2020;18:2312-2325. Published 2020 Aug 7. doi:10.1016/j.csbj.2020.08.003
- Chang TC, Matossian MD, Elliott S, et al. Evaluation of deacetylase inhibition in metaplastic breast carcinoma using multiple derivations of preclinical models of a new patientderived tumor. PLoS One. 2020;15(10):e0226464. Published 2020 Oct 9. doi:10.1371/journal.pone.0226464
- Kan A. Machine learning applications in cell image analysis. Immunology and Cell Biology. 2017; 95: 525-530.
- Midtvedt B, Helgadottir S, Argun A, et al. Quantitative digital microscopy with deep learning. Applied Physics Reviews. 19 February 2021, DOI: 10.1063/5.0034891
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các Hệ thống ghi nhận hình ảnh tế bào hãng Molecular Devices
EN