Phân tích chính xác các chỉ số sinh học với phương pháp đếm tế bào dòng chảy

Đo chính xác các chỉ số sinh học trong các quần thể tế bào không đồng nhất, chẳng hạn như mẫu mô, có thể là một thách thức. Khi các nhà nghiên cứu sử dụng các phương pháp khối truyền thống để phân tích các mẫu tế bào, họ thu được một kết quả đọc duy nhất đại diện cho giá trị trung bình trên tất cả các tế bào. Không có cách nào để biết liệu tín hiệu có đến từ biểu hiện thấp đến trung bình của mục tiêu trong toàn bộ quần thể hay từ một vài tế bào có biểu hiện cao. Ngoài ra, các quần thể tế bào phong phú hơn làm loãng các tín hiệu yếu hơn. Vì vậy, phân tích tế bào tổng thể làm che khuất các kiểu hình và sự kiện hiếm gặp trong các quần thể tế bào không đồng nhất.

Ngoài phân tích tổng thể

Western blotting là phương pháp phổ biến để nhận dạng protein. Thay vì chạy mẫu trên gel và khảo sát màng, các nhà khoa học có thể nắm bắt toàn bộ sự đa dạng của quần thể tế bào bằng cách phân tích các tế bào đơn lẻ bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy

Đếm tế bào dòng chảy cho phép các nhà khoa học theo dõi nhiều dấu hiệu bề mặt hoặc nội bào trong một thí nghiệm bằng cách sử dụng các kháng thể huỳnh quang hoặc vết nhuộm khác nhau. Western blot cho thấy hai hoặc ba protein cùng một lúc và việc đánh giá chính xác nguồn gốc mô của các protein mục tiêu từ các mẫu không đồng nhất là rất khó (Box 1). Ghép kênh với đếm tế bào dòng chảy tạo ra các tập dữ liệu định lượng phức tạp chứa nhiều thông tin, chẳng hạn như biểu diễn phân nhóm tế bào, lượng protein mục tiêu và hoạt động của protein. Máy phân tích tế bào dòng chảy cũng có khả năng tách các tế bào có đặc điểm tương tự để phân tích thêm.

Để protein mục tiêu có thể nhìn thấy được trong bước phát hiện Western blot, các nhà nghiên cứu phải sử dụng một lượng mẫu lớn. Một trong những điểm mạnh của phép đo lưu lượng tế bào là khả năng phát hiện lượng protein rất nhỏ, ngay cả trên các tế bào đơn lẻ. Điều này có lợi cho các nhà nghiên cứu sử dụng các mẫu quý giá có thể hết hoặc cần mở rộng ex vivo khi thực hiện nhiều phân tích Western blot.

Trong một ví dụ ban đầu về phân tích tế bào đơn thông qua đếm tế bào dòng chảy, một nhóm các nhà nghiên cứu do Garry Nolan từ Đại học Stanford đã theo dõi các sự kiện truyền tín hiệu trong các tế bào ung thư của bệnh nhân bằng cách xác định các protein đã phosphoryl hóa. ¹ Sự phosphoryl hóa protein được kiểm soát bởi các enzyme kinase và phosphatase gây ra những thay đổi nhanh chóng bên trong tế bào. Các đột biến trong tín hiệu tế bào và những thay đổi biểu sinh trong các kiểu biểu hiện gen có thể dẫn đến ung thư. ² Trong nghiên cứu này, các nhà nghiên cứu đã đo nhiều thông số trong 50.000 tế bào đơn từ 30 mẫu bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu tủy cấp tính. Các nhà nghiên cứu đã cho các mẫu bệnh nhân tiếp xúc với các đầu vào truyền tín hiệu, chẳng hạn như cytokine, và phát hiện các sự kiện truyền tín hiệu phospho bằng các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các dạng protein mục tiêu đã phosphoryl hóa. Việc phân tích các mẫu bằng phương pháp western blot sẽ yêu cầu hai blot cho mỗi protein mục tiêu—một blot phát hiện protein đã phosphoryl hóa và một blot khác phát hiện tổng mức protein mục tiêu.

Dựa trên dữ liệu của họ, các nhà nghiên cứu đã liên kết hoạt động của protein với kết quả kiểu hình và xây dựng hàng triệu mạng lưới phản ứng cytokine có mối tương quan giữa truyền tín hiệu với di truyền của bệnh nhân và kết quả bệnh. ¹ Trước khi có phương pháp đo lưu lượng tế bào đa kênh, không thể thực hiện nghiên cứu ở quy mô này. Nghiên cứu này đã nâng cao hiểu biết của các nhà khoa học về tín hiệu ung thư trong môi trường vi mô khối u không đồng nhất.

Hệ thống sinh học

Các nhà nghiên cứu thường có cái nhìn toàn diện khi hiểu về sinh học của đối tượng nghiên cứu. Bằng cách đo nhiều chỉ số sinh học bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy, họ có thể theo dõi các con đường phân tử trong các mạng lưới tế bào phức tạp. Với kiến ​​thức sâu hơn về các hệ thống sinh học, các nhà nghiên cứu sẽ hiểu rõ hơn về các hệ thống này trong sức khỏe và bệnh tật.

Bên trong tế bào

Trạng thái chuyển hóa của tế bào cung cấp thông tin về nhiều quá trình và có một số bảng kháng thể đếm tế bào dòng chảy phát hiện các enzyme chuyển hóa, chất vận chuyển và các dấu hiệu kiểu hình. Ngoài protein, các phân tử huỳnh quang được hấp thụ, sản xuất hoặc thay đổi trong các phản ứng chuyển hóa giúp các nhà nghiên cứu tiếp cận được thế giới bên trong tế bào. Các nhà khoa học sử dụng đếm tế bào dòng chảy để phát hiện những thay đổi về chuyển hóa trong các tế bào miễn dịch để đáp ứng với ung thư, ³ trong vi khuẩn gây bệnh không thể nuôi cấy từ các mẫu môi trường, ⁴ và trong các tế bào gốc ung thư trong các quần thể không đồng nhất. ⁵

Sự thay đổi quá trình chuyển hóa của các tế bào ung thư, chẳng hạn như sự gia tăng quá trình đường phân hiếu khí, thúc đẩy sự sống còn và tăng sinh của chúng. ⁶ Vì nhiều loại thuốc nhắm vào các con đường chuyển hóa, các nhà khoa học có thể phân tích quá trình chuyển hóa của tế bào ung thư để dự đoán phản ứng của tế bào đối với hóa trị liệu. ⁷ Trong một ví dụ, các nhà nghiên cứu đã sử dụng phương pháp đếm tế bào dòng chảy để theo dõi các cofactor chuyển hóa tự huỳnh quang NADH, NADPH (gọi chung là NAD(P)H) và FAD trong từng tế bào ung thư vú. ⁸ Tỷ lệ NAD(P)H so với FAD thấp hơn ở các tế bào ung thư vú đáp ứng với điều trị so với các tế bào kháng thuốc. Phát hiện các cofactor huỳnh quang bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy  đã được chứng minh là một kỹ thuật hiệu quả để phân biệt các tế bào dễ bị tổn thương và kháng thuốc. Hiện nay, các nhà khoa học có thể phân tích quá trình chuyển hóa của tế bào ung thư trong các mẫu mô không đồng nhất thông qua phương pháp đo lưu lượng tế bào để xác định các phân nhóm có khả năng kháng thuốc.

Giữa các tế bào

Nhờ sự ra đời của các kỹ thuật tế bào đơn, các nhà nghiên cứu đang có được hiểu biết sâu sắc về môi trường vi mô khối u (TME) của nhiều loại ung thư. Khối u bao gồm hỗn hợp không đồng nhất giữa tế bào ung thư và tế bào bình thường. Sử dụng phương pháp đếm tế bào dòng chảy , các nhà nghiên cứu có thể xác định các loại tế bào có trong TME và nhiều quá trình tế bào của chúng, chẳng hạn như phân chia tế bào, sự kiện truyền tín hiệu và đột biến. ⁹

Phân tích tế bào dòng chảy đa kênh đặc biệt hữu ích cho các nhà nghiên cứu đang nghiên cứu các tế bào miễn dịch, chẳng hạn như tế bào lympho thâm nhiễm khối u (TIL). TIL cực kỳ đa dạng và có thể làm tăng hoặc giảm phản ứng miễn dịch đối với các tế bào khối u. Các nhà khoa học xác định các phân nhóm TIL bằng cách phân tích các dấu ấn sinh học trên bề mặt tế bào bằng một kỹ thuật gọi là miễn dịch kiểu hình. Các nhà khoa học hiện có thể sử dụng các bảng kháng thể chuẩn hóa để phân tích miễn dịch kiểu hình tế bào dòng chảy. ¹⁰ (Box 2)

Các nhà khoa học có được góc nhìn mới về môi trường và sức khỏe con người thông qua nghiên cứu hệ vi sinh vật. Các cộng đồng vi khuẩn tồn tại trên bề mặt rất phức tạp và năng động. Vì hệ vi sinh vật ảnh hưởng đến sức khỏe của vật chủ là con người, nên ¹³nhà nghiên cứu mong muốn có các phương pháp đáng tin cậy để phân tích các quần thể này.Theo truyền thống, các nhà khoa học phân tích các cộng đồng vi khuẩn bằng phương pháp nuôi cấy; tuy nhiên, nhiều vi khuẩn không thể nuôi cấy. Trong khi giải trình tự thế hệ tiếp theo của các mẫu vi sinh vật cung cấp một lượng lớn thông tin phân loại, thì nó còn lâu mới trở thành một phương pháp phân tích thông thường. Nó có xu hướng đánh giá quá cao sự đa dạng của vi khuẩn trong một quần thể, không dễ chuẩn hóa, tốn kém và đòi hỏi phải phân tích bởi những cá nhân có chuyên môn về tin sinh học để phân loại dữ liệu. ¹⁴ Sai sót trong quá trình phân lập DNA có thể làm sai lệch kết quả, giảm thiểu sự đóng góp của các loài khó phân hủy hơn trong quá trình chuẩn bị mẫu.Để khám phá động lực của cộng đồng vi khuẩn theo thời gian, các nhà khoa học có thể sử dụng phân tích dựa trên tế bào đơn lẻ của hệ vi sinh vật thông qua phép đo tế bào dòng chảy có độ phân giải cao hoặc lập hồ sơ hệ vi sinh vật bằng phương pháp đếm tế bào. Với kỹ thuật này, các nhà khoa học đo độ tán xạ ánh sáng về phía trước của mẫu hệ vi sinh vật để xác định kích thước tế bào và nhuộm bằng DAPI huỳnh quang để đo định lượng hàm lượng DNA. Với hai thông số này, các nhà nghiên cứu có thể phân giải hơn 50 phân quần thể đồng nhất về mặt phát sinh loài trong một mẫu hệ vi sinh vật chỉ trong một thí nghiệm. ¹⁵ Các nhà nghiên cứu có thể theo dõi hệ vi sinh vật theo thời gian và đánh giá chúng để tìm ra những thay đổi về thành phần và số lượng tế bào trong các điều kiện khác nhau. Ngoài ra, các nhà nghiên cứu có thể phân lập các quần thể đã xác định bằng cách sử dụng phương pháp phân loại tế bào để thực hiện các kỹ thuật sinh học phân tử bổ sung.

Tài liệu tham khảo