Giới thiệu
Liệu pháp miễn dịch ngày càng trở nên phổ biến như một phương pháp điều trị ung thư. Các liệu pháp này bao gồm Liệu pháp tế bào CAR T, U lympho tế bào T (TIL), và các tế bào T biến đổi gen khác nhằm nhắm đích đặc hiệu đến các tế bào ung thư. Mặc dù liệu pháp miễn dịch đã đạt được nhiều thành công trong điều trị các bệnh ung thư máu, hiệu quả của nó vẫn còn hạn chế đối với các khối u đặc. Một trong những nguyên nhân dẫn đến tỷ lệ thành công thấp này là do vi môi trường khối u đặc (TME), nơi các cytokine ức chế làm giảm khả năng tiêu diệt khối u của tế bào T. Do đó, việc hiểu rõ vai trò của TME trong phản ứng của tế bào T là rất quan trọng để phát triển các liệu pháp ung thư hiệu quả.
Việc sử dụng organoids 3D từ tế bào ung thư mang lại nhiều lợi ích nhờ mô phỏng được các tín hiệu vật lý và hóa học có trong TME – những yếu tố mà mô hình 2D nuôi cấy tế bào đơn truyền thống không thể tái hiện. Các nghiên cứu cho thấy PDOs có phản ứng với thuốc tương tự như khối u gốc, cho thấy giá trị của việc sử dụng PDOs trong cải thiện hiệu quả điều trị. Điều này có nghĩa là PDOs là mô hình ung thư phù hợp hơn về mặt sinh lý và bệnh lý, có thể tái tạo các đặc điểm cơ bản của khối u nguyên phát và phù hợp hơn để đánh giá hiệu quả tiêu diệt tế bào của tế bào T so với các mô hình tế bào 2D.
Lợi ích:
- Quy trình dễ triển khai để đánh giá tương tác giữa tế bào T và organoids trong môi trường in vitro
- Phương pháp mới để phân tích tương tác của tế bào T đến organoid
- Tận dụng tự động hóa cho time-lapse và phân tích hình ảnh chất lượng cao
Mặc dù việc sử dụng PDOs mang lại nhiều lợi ích, vẫn tồn tại những rào cản đáng kể đối với việc áp dụng rộng rãi chúng trong phát triển thuốc. Quá trình tạo PDO rất tốn kém và đòi hỏi nhiều thời gian thực hiện thủ công. Hơn nữa, việc nuôi cấy organoid là một quy trình đòi hỏi kỹ năng cao và có sự khác biệt đáng kể giữa các kỹ thuật viên. Để giải quyết những thách thức này khi áp dụng PDOs trong các ứng dụng quy mô lớn, một quy trình bán tự động đã được phát triển nhằm mở rộng số lượng organoids sẵn sàng cho xét nghiệm. Trong nghiên cứu này, Molecular Devices đã xây dựng một phương pháp để đánh giá hiệu quả xâm nhập của tế bào T vào khối u đặc bằng cách sử dụng PDOs. Sử dụng organoids từ tế bào ung thư đại trực tràng (CRCs) được nuôi cấy trong bioreactor, các tế bào đơn nhân từ máu ngoại vi (PBMCs) được hoạt hóa, nhuộm huỳnh quang bằng chất CellTracker và được thêm vào CRCs (đã nhuộm với MitoTracker) trong Máy đọc đĩa vi tấm 96 giếng. Quá trình tương tác được theo dõi mỗi 4 giờ trong vòng 3 ngày với Hệ thống quan sát và ghi nhận hình ảnh tế bào. Để định lượng mức độ xâm nhập của tế bào T, Molecular Devices phát triển một phương pháp phân tích hình ảnh nhằm đo khoảng cách từ mỗi tế bào T đến organoid gần nhất. Kết quả cho thấy các tế bào T được kích hoạt có khoảng cách tương tác ngắn hơn so với tế bào T không được kích hoạt. Những kết quả này chứng minh tính ứng dụng của organoid được nuôi cấy trong bioreactor trong các sàng lọc quy mô lớn dựa trên tế bào T.
Thiết bị và phương pháp
Quy trình thực nghiệm
CRCs được nuôi mở rộng bằng bioreactor đã được rã đông và nuôi cấy trong 80% Matrigel® (loại giảm yếu tố tăng trưởng, Corning). Sau 48 giờ, organoids được thu thập, nhuộm với thuốc nhuộm MitoTracker Red (Thermo Fisher Scientific, theo nồng độ khuyến cáo của nhà sản xuất), sau đó được huyền phù lại trong 3% Matrigel và nuôi cấy trong đĩa đáy phẳng 384 giếng có khả năng bám dính cực thấp (Corning). Các tế bào PBMC/tế bào T sau khi rã đông được kích hoạt bằng PMA/i trong 6 giờ, rồi nhuộm với CellTracker Green (Thermo Fisher Scientific, theo nồng độ khuyến cáo của nhà sản xuất) trước khi được thêm vào các CRC organoids để đồng nuôi cấy. Molecular Devices sử dụng Hệ thống quan sát và ghi nhận hình ảnh tế bào ImageXpress® Confocal HT.ai (Molecular Devices) được trang bị hệ thống quét đĩa quay và camera sCMOS để thực hiện chụp ảnh tế bào sống định kỳ mỗi 4 giờ.
Hình 1. Quy trình đánh giá tương tác giữa T-cell và CRC PDO (sử dụng tế bào T không kích hoạt làm đối chứng)
Thiết lập tự động hóa
Hệ thông làm việc tự động gồm máy ủ và Hệ thống khảo sát tế bào (Hình 2) đã được sử dụng để theo dõi quá trình đồng nuôi cấy giữa organoids và tế bào T. Phần mềm Genera (RETISOFT) được sử dụng để thực hiện việc theo dõi định kỳ các organoids trong quá trình nuôi cấy. Quy trình bao gồm: lấy đĩa nuôi cấy ra khỏi máy ủ, vận chuyển đĩa đến hệ thống ImageXpress Confocal HT.ai để chụp ảnh organoids mỗi 4 giờ (z-stack acquisition, 10X), và sau đó đưa đĩa trở lại vào máy ủ bằng cánh tay robot PreciseFlex400 (Brooks).
Hình 2: Sơ đồ bố trí hệ thống tự động. Quy trình làm việc tiêu chuẩn hóa này bao gồm các thiết bị: máy xử lý chất lỏng (Hamilton), cánh tay robot (Brooks), máy ủ (LiCONiC), hệ thống ImageXpress Confocal HT.ai (Molecular Devices), hệ thống quan sát và ghi nhận hình ảnh tế bào tự động ImageXpress Pico (Molecular Devices), Máy đọc đĩa vi tấm đa năng SpectraMax® iD5 (Molecular Devices), Máy rửa đĩa vi tấm AquaMax® (Molecular Devices), kho chứa đĩa, máy ly tâm và máy quét mã vạch. Các mũi tên cong minh họa một quy trình ví dụ để theo dõi tế bào trong quá trình nuôi cấy, trong đó đĩa được di chuyển từ máy ủ đến hệ thống ImageXpress Confocal HT.ai để chụp ảnh và sau đó đưa trở lại máy ủ.
Tối ưu hóa thử nghiệm
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng tế bào T di chuyển kém trong ma trận collagen đặc. Do organoids được nuôi trong nồng độ Matrigel cao (80%), điều này có thể cản trở sự di chuyển của tế bào T, nên Molecular Deviecs đã tiến hành tối ưu hóa thử nghiệm bằng cách xác định lượng Matrigel tối thiểu cần thiết để duy trì organoids trong quá trình nuôi cấy. Lý tưởng nhất, lượng Matrigel sử dụng phải đủ để giữ được cấu trúc CRC trong khi vẫn cho phép tế bào T di chuyển tự do về phía khối organoids. Các CRC organoids trong 80% Matrigel tiếp tục phát triển kích thước, trong khi các organoids được cấy trong Matrigel 3%, 5% hoặc 10% không có sự thay đổi đáng kể về kích thước. Đáng chú ý, organoids trong môi trường nuôi cấy không có Matrigel chỉ tăng kích thước nhẹ, điều này có thể do ảnh hưởng của các đặc tính cơ học của Matrigel (như độ cứng) đến hình thái của organoids. Từ kết quả trên, lựa chọn sử dụng Matrigel ở nồng độ 3% để tối đa hóa hiệu quả xâm nhập của tế bào T trong khi vẫn duy trì được cấu trúc tổng thể của organoid
Hình 3. Mix organoids với (A) 0% (chỉ môi trường), (B) 3%, (C) 5%, (D) 10% và (E) 80% Matrigel tại thời điểm bắt đầu nuôi cấy (0 giờ); sự phát triển của organoid sau 52 giờ với (F) 0%, (G) 3%, (H) 5%, (I) 10% và (J) 80% Matrigel; (K) Phần mềm phân tích hình ảnh IN Carta® được sử dụng để đo diện tích của các organoid; (L) Tốc độ tăng trưởng trung bình của organoid trong 52 giờ tương ứng với các nồng độ Matrigel khác nhau. Độ lệch chuẩn được thể hiện bằng các thanh sai số.
Kết quả
Tương tác giữa tế bào T và organoids từ tế bào ung thư (PDOs)
Molecular Devices quan sát thấy rằng tế bào T và organoids có mức độ di động khác nhau trong quá trình nuôi cấy. Hình 4 thể hiện tiến trình tương tác qua lại dần tăng lên giữa tế bào T và CRC organoids. Các tế bào T đã được kích hoạt có xu hướng tập trung xung quanh organoids (Hình 4A), trong khi các tế bào T chưa kích hoạt thì không. So với điều kiện không kích hoạt, trong đó vị trí tương đối của organoids hầu như không thay đổi, các tế bào T được kích hoạt dường như còn làm dịch chuyển organoids trong môi trường nuôi cấy (xem các mũi tên trắng trong Hình 4A).
Phân tích mức độ tích tụ của tế bào T
Để định lượng số lượng tế bào T xung quanh organoids, trước tiên tiến hành đo khoảng cách từ mỗi tế bào T đến organoids gần nhất (không tính các tế bào T đã xâm nhập vào bên trong organoids) (Hình 5A–5F), sử dụng trình chỉnh sửa module tùy biến (CME) trong phần mềm phân tích hình ảnh MetaXpress®. Chỉ những tế bào T nằm trong phạm vi 50 µm so với MetaXpress mới được phân tích. Kết quả cho thấy tế bào T có xu hướng tập trung tại rìa organoids theo thời gian. Số lượng tế bào T cao nhất tại vùng rìa được ghi nhận sau 24 giờ xử lý (Thời điểm 6, Hình 5). Ngược lại, các tế bào T không kích hoạt không cho thấy sự tích tụ ưu tiên quanh organoids mà chủ yếu tụ lại ở đáy giếng nuôi cấy.
Hình 4. Tích tụ của tế bào T quanh organoids (A) Tế bào T đã được kích hoạt tích tụ xung quanh rìa organoids và kéo các organoids lại gần nhau theo thời gian. (B) Tế bào T không được kích hoạt chỉ tích tụ ở rìa đáy giếng mà không ảnh hưởng đến organoids
Hình 5. Đo khoảng cách giữa tế bào T và organoids (A) Nhuộm MitoTracker Red cho ty thể trong organoids. (B) organoid masks được tạo từ ảnh nhuộm MitoTracker, thể hiện ranh giới của từng organoids. (C) Ảnh thang xám 16-bit, trong đó giá trị pixel biểu thị khoảng cách đến điểm gần nhất trong ảnh (B). (D) Nhuộm CellTracker Green cho tế bào T. (E) T-cell masks được tạo từ ảnh nhuộm CellTracker. (F) Khoảng cách từ mỗi tế bào T đến organoids gần nhất được đo bằng cách chồng ảnh (C) và (E).
Kết luận
- Molecular Devices đã sử dụng Hệ thống quan sát và ghi nhận hình ảnh tế bào ImageXpress Confocal HT.ai để theo dõi tương tác giữa tế bào T và organoids theo thời gian thực bằng phương pháp time-lapse
- Phân tích mức độ tích tụ của tế bào T tại rìa organoids được thực hiện thông qua trình chỉnh sửa module tùy biến (CME).
- Molecular Devices đề xuất một quy trình mới nhằm đo lường và đánh giá tương tác giữa tế bào T và organoids một cách chính xác và hiệu quả.
Tài liệu tham khảo
- Quantification of Visco-Elastic Properties of a Matrigel for Organoid Development as a Function of Polymer Concentration
- Xiangming Liu, Yuemei Qiao, JianFeng Chen, Gaoxiang Ge, Basement membrane promotes tumor development by attenuating T cell activation, Journal of Molecular Cell Biology, Volume 14, Issue 2, February 2022
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp Hệ thống quan sát và ghi nhận hình ảnh tế bào từ hãng Molecular Devices
EN