Tài liệu chuyên đề này trình bày các nguyên nhân dẫn đến hiện tượng thu hồi nội độc tố ở mức thấp (LER), những tác động mà hiện tượng này gây ra, các giải pháp có thể khắc phục vấn đề, bên cạnh đó cũng phân tích ưu điểm và hạn chế của việc tự phát triển quy trình phục hồi hoạt tính nội độc tố (de-masking), và cách sử dụng bộ kit ENDO-RS® để đơn giản hóa quy trình này từ đầu đến cuối. Tiếp theo, tài liệu sẽ làm rõ lợi ích và rủi ro của việc thuê ngoài cho phục hồi hoạt tính nội độc tố, những yếu tố nên cân nhắc khi lựa chọn đối tác bên thứ ba, và lý do có thể – và nên – tin tưởng bioMérieux trong việc phát triển quy trình này.
Giới thiệu
Ngành dược đang ngày càng phát triển. Hãy lấy ví dụ: trước đây, các phân tử nhỏ từng chiếm ưu thế trong ngành công nghiệp dược phẩm. Thế nhưng ngày nay, số lượng các sản phẩm sinh học như kháng thể và protein đang ngày càng gia tăng trên thị trường. Tính đến thời điểm hiện tại, đã có hơn 400 liệu pháp tái tổ hợp được FDA phê duyệt, cho thấy sinh phẩm mang lại nhiều lợi ích như hiệu quả điều trị cao hơn, độ đặc hiệu tốt hơn, đồng thời giảm độc tính và nguy cơ gây tác dụng phụ nghiêm trọng.
Tuy nhiên, quy trình sản xuất các chế phẩm sinh học ổn định lại thường gặp phải một vấn đề cụ thể: phát hiện nội độc tố. Nội độc tố là những phân tử lipopolysaccharide (LPS) từ thành tế bào của vi khuẩn gram âm, có khả năng gây phản ứng miễn dịch nghiêm trọng ở bệnh nhân, dẫn đến nhiễm trùng huyết (sepsis), thậm chí tử vong
Phát hiện nội độc tố là một bước quan trọng trong quy trình kiểm soát chất lượng thuốc. Tất cả các sản phẩm y tế và dược phẩm vô trùng có khả năng tiếp xúc với máu bệnh nhân, hoặc với dịch não tủy hay dịch nhãn cầu, đều phải được kiểm tra nội độc tố trước khi lưu hành. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nội độc tố bị “che khuất” có thể khiến các phương pháp thử nội độc tố phổ biến trở nên không đáng tin cậy – hiện tượng này được gọi là “thu hồi nội độc tố ở mức thấp” (LER – Low Endotoxin Recovery).
bioMérieux đã có cuộc trao đổi với chuyên gia Tiến sĩ Christian Faderl để tìm hiểu kỹ hơn về nội độc tố bị che khuất và cách các nhà sản xuất dược phẩm có thể giải quyết hiệu quả vấn đề LER.
Che khuất nội độc tố: Hiểu rõ những mối nguy tiềm ẩn
Hiện nay có một số phương pháp được sử dụng để kiểm tra nội độc tố vi khuẩn, bao gồm: limulus amebocyte lysate (LAL), tachypleus amebocyte lysate (TAL) và Tái tổ hợp Factor C (recombinant Factor C – rFC).
Tuy nhiên, tất cả các phương pháp này đều dựa vào một loại protein gọi là Yếu tố C (Factor C), protein này có khả năng gắn với các phân tử LPS (lipopolysaccharide) và kích hoạt một chuỗi phản ứng, từ đó giúp phát hiện và định lượng nội độc tố. Điều quan trọng là: Factor C chỉ được kích hoạt bởi LPS ở dạng tự nhiên, kết tụ
Trong sản xuất sinh phẩm và bào chế thành phẩm cuối cùng, các quy trình thường sử dụng chất hoạt động bề mặt polysorbate để ngăn ngừa sự kết tụ của protein, cùng với các dung dịch đệm có khả năng tạo phức (chelating buffers) nhằm duy trì độ pH tối ưu.
Những thành phần này (chất hoạt động bề mặt và dung dịch đệm) là yếu tố thiết yếu để đảm bảo sinh phẩm có độ ổn định, duy trì được cấu trúc và chức năng sinh học. Tuy nhiên, chúng cũng có thể phá vỡ cấu trúc kết tụ của LPS, khiến các phân tử LPS phân tán hoàn toàn thành dạng monomer trong dung dịch. Khi ở dạng monomer đã phân tán, LPS không còn khả năng kích hoạt Factor C, dẫn đến việc các xét nghiệm nội độc tố không phát hiện được, gây ra kết quả âm tính giả
Tiến sĩ Joseph Chen là người đầu tiên báo cáo hiện tượng LER (thu hồi nội độc tố ở mức thấp) tại Hội nghị thường niên PDA năm 2013. Ông đã chứng minh rằng, khi thêm một lượng nhỏ nội độc tố vào các chế phẩm sinh học chưa pha loãng, các phương pháp xét nghiệm nội độc tố hiện hành không thể phát hiện được chúng. Kể từ đó, nhiều nghiên cứu khác đã tiếp tục xác nhận tác động của hiện tượng che khuất nội độc tố và LER.
“LER là một rủi ro an toàn nghiêm trọng đối với bệnh nhân,” Tiến sĩ Faderl nhận định. “Nếu một sản phẩm gặp vấn đề LER, nội độc tố sẽ bị che khuất, vì vậy bạn không thể phát hiện được sự nhiễm bẩn trong quá trình kiểm tra chất lượng. Tuy nhiên, che khuất nội độc tố vẫn có thể kích hoạt phản ứng miễn dịch.”
Một nghiên cứu gần đây của các nhà khoa học đến từ Đại học Salzburg đã cho thấy rằng nội độc tố bị che khuất vẫn có thể kích thích phản ứng của bạch cầu người, ngay cả khi chúng chỉ hiện diện ở nồng độ rất thấp.
Sản phẩm của bạn có đang chứa nội độc tố “khuất”?
“Việc kiểm tra sản phẩm để phát hiện LER là vô cùng quan trọng. Nếu có vấn đề liên quan đến LER, bắt buộc phải xử lý bằng cách phục hồi hoạt tính nội độc tố, để có thể tiến hành các xét nghiệm nội độc tố chính xác trong quá trình kiểm tra chất lượng và kiểm định trước khi lưu hành,” Tiến sĩ Faderl nhấn mạnh.
Các cơ quan quản lý cũng đồng tình với quan điểm của Tiến sĩ Faderl, và các công ty sản xuất sinh phẩm bị yêu cầu phải chứng minh rằng sản phẩm của họ không gặp vấn đề che khuất nội độc tố (LER) trong quá trình sản xuất. “Các nghiên cứu về thời gian lưu trữ có thể cho biết liệu bạn có đang gặp vấn đề về LER hay không,” Tiến sĩ Faderl giải thích. “Để thực hiện nghiên cứu này, hãy thực hiện tiêm một lượng nội độc tố chuẩn vào sản phẩm chưa pha loãng, sau đó mô phỏng quy trình sản xuất thực tế. Tiếp theo, để mẫu ở nhiệt độ phòng trong một khoảng thời gian nhất định, thường là bảy ngày.
Trong thời gian tiến hành kiểm tra nội độc tố tại các mốc thời gian cụ thể, ví dụ: ngay sau khi tiêm nội độc tố, sau 4 giờ, 6 giờ, 1 ngày, 3 ngày và 7 ngày. Nếu bạn có thể phát hiện đầy đủ lượng nội độc tố tại mọi thời điểm, nằm trong khoảng hồi phục từ 50–200%, thì không có vấn đề về LER. Nhưng nếu kết quả hồi phục nội độc tố dưới 50% trong hai mốc thời gian liên tiếp, thì đó là một dấu hiệu rõ ràng cho thấy có vấn đề.”
Các nhà sản xuất gặp vấn đề về LER cần xác định nguyên nhân gây che khuất nội độc tố, đồng thời phát triển giải pháp để phục hồi hoạt tính nội độc tốố, nhằm giúp các xét nghiệm nội độc tố có thể phát hiện được chúng, đảm bảo kiểm soát chất lượng đáng tin cậy. Một giải pháp tạm thời có thể là tiêm sản phẩm thuốc vào thỏ và theo dõi phản ứng miễn dịch — phương pháp này gọi là Rabbit Pyrogen Test.
Tuy nhiên, đây không phải là giải pháp lâu dài phù hợp, vì ngành công nghiệp đang hướng tới việc loại bỏ thử nghiệm trên động vật, thay vào đó sử dụng các xét nghiệm hóa học hoặc sinh học để đánh giá.
Triển khai nội bộ các quy trình thu hồi nội độc tố (LER)
Hiện tượng che khuất nội độc tố là kết quả của các tương tác hóa học đặc thù, phụ thuộc vào công thức thuốc và quy trình sản xuất cụ thể của từng sản phẩm.
Tùy thuộc vào loại thuốc, đôi khi có thể có giải pháp đơn giản – ví dụ như thay đổi loại chai/lọ chứa mẫu, hoặc bổ sung magie clorua (MgCl₂) trước khi tiến hành xét nghiệm nội độc tố. Tuy nhiên, trường hợp này chỉ chiếm khoảng 5% tổng số dự án.
Trong phần lớn các dự án còn lại, cần phải thực hiện một quy trình nghiên cứu sâu hơn để hiểu rõ các tương tác phân tử gây ra hiện tượng LER, và từ đó xác định cách phục hồi hoạt tính nội độc tố sao cho hiệu quả. Báo cáo kỹ thuật số 82 mới được công bố của PDA (PDA Technical Report No. 82) đã nêu rõ các quy trình được khuyến nghị để phân tích và xử lý hiện tượng che khuất nội độc tố, nguyên nhân thường gặp gây ra LER trong các sản phẩm sinh học.
“Bạn cần có rất nhiều kiến thức, kinh nghiệm và nguồn lực để xử lý được LER,” Tiến sĩ Faderl chia sẻ. “Không hề đơn giản, bởi vì việc cần làm sẽ phụ thuộc vào chính sản phẩm thuốc của bạn, và cũng phụ thuộc vào yếu tố nào đang gây ra hiện tượng LER. Cần biết cách thiết kế thí nghiệm, cần biết thêm gì vào mẫu để xây dựng một quy trình phục hồi hoạt tính nội độc tố hiệu quả, ổn định, và có thể áp dụng được trong quy trình kiểm tra chất lượng hàng ngày. Thông thường cần ít nhất hai kỹ thuật viên làm việc toàn thời gian để thực hiện toàn bộ các thí nghiệm cần thiết – và chi phí cho việc này là rất cao”
Lợi thế của việc phát triển quy trình thu hồi nội độc tố ngay tại nội bộ là sự chủ động và tiện lợi, đi kèm với sự yên tâm rằng phương pháp do chính bạn xây dựng sẽ hoạt động hiệu quả trong quy trình kiểm soát chất lượng và tại phòng thí nghiệm.
Tuy nhiên, việc phát triển quy trình phục hồi hoạt tính nội độc tố đòi hỏi kiến thức chuyên môn sâu và nguồn lực đặc thù – trong đó tối thiểu là một đội ngũ có đủ năng lực để thực hiện công việc. Đây là một lĩnh vực còn tương đối mới, do đó, ngay cả những người chuyên về xét nghiệm nội độc tố cũng chưa chắc đã có kinh nghiệm với vấn đề này
Tất nhiên, một khi đã đầu tư vào những nguồn lực này, chúng sẽ trở thành tài sản nội bộ có thể sử dụng lâu dài. Tuy nhiên, nhiều nhà sản xuất lại đánh giá thấp thời gian và chi phí cần thiết để xây dựng đầy đủ quy trình
Thiết lập quy trình nội bộ với bộ kit thu hồi nội độc tố
Nếu có đầy đủ nguồn lực để phát triển quy trình phục hồi hoạt tính nội độc tố nội bộ ,có thể sử dụng bộ kit thu hồi nội độc tố như ENDO-RS® của bioMérieux để đơn giản hóa quy trình và tăng độ tin cậy.
Việc phát triển quy trình phục hồi hoạt tính nội độc tố bằng ENDO-RS® đã được đưa vào Báo cáo Kỹ thuật số 82 của PDA, trong Case Study 7: Đánh giá một quy trình phục hồi hoạt tính nội độc tố, mô tả việc ứng dụng phương pháp ENDO-RS® do Hyglos (nay thuộc bioMérieux) phát triển.
ENDO-RS® là một bộ công cụ độc đáo dùng cho bước chuẩn bị mẫu trong xét nghiệm nội độc tố vi khuẩn, nhằm giải quyết vấn đề che khuất nội độc tố. Bộ kit này sử dụng một phương pháp sinh hóa tiên tiến, hiệu quả, giúp thu hồi nội độc tố hoàn toàn trong các công thức sinh phẩm, với thành phần chứa chất hoạt động bề mặt và tác nhân tạo phức, đồng thời không bị ảnh hưởng bởi thời gian bảo quản hay nồng độ nội độc tố.
Kết hợp ENDO-RS® với xét nghiệm nội độc tố ENDOLISA® cho phép xác định chính xác nội độc tố trong các chế phẩm sinh học có chứa chất hoạt động bề mặt (ví dụ: polysorbate). Đáng chú ý là ENDO-RS® cũng có thể kết hợp với các phương pháp xét nghiệm nội độc tố khác, mang lại tính linh hoạt tối đa.
Trong Case Study 7, các hóa chất của ENDO-RS® được sử dụng cho một mẫu có vấn đề về LER, để phục hồi hoạt tính nội độc tố trước khi xét nghiệm bằng phương pháp LAL. Kết quả cho thấy ENDO-RS® có khả năng thu hồi một cách đáng tin cậy, cho phép LAL phát hiện được nội độc tố trong mẫu.
Quy trình thu hồi nội độc tố đã được lặp lại vào những ngày khác nhau, bởi các nhân sự khác nhau, và trên 21 lần thử nghiệm, sự dao động trong kết quả thu hồi nội độc tố chỉ là 20%. Các thí nghiệm cũng kiểm tra độ ổn định (robustness) của bộ kit bằng cách thay đổi nhiều điều kiện như: thời gian ủ, thời gian vortex, nhiệt độ, loại thuốc, quy trình xét nghiệm nội độc tố và nguồn LPS.
Kết quả cho thấy rằng, sau khi áp dụng quy trình thu hồi nội độc tố bằng ENDO-RS®, mức độ thu hồi nội độc tố đều nằm trong giới hạn hợp lệ với mọi điều kiện được thử nghiệm. Do đó, nhóm nghiên cứu kết luận rằng việc sử dụng bộ kit ENDO-RS® đảm bảo khả năng thu hồi nội độc tố hiệu quả, đồng thời loại bỏ nguy cơ âm tính giả trong các xét nghiệm nội độc tố vi khuẩn.
Giải quyết vấn đề LER bằng cách thuê ngoài quy trình thu hồi nội độc tố
Nếu không có đủ nguồn lực để tự phát triển thu hồi nội độc tố, thì thuê ngoài quá trình phát triển này có thể là một giải pháp tiết kiệm thời gian và chi phí để giải quyết vấn đề LER mà bạn đang gặp phải. Thêm vào đó, cách làm này cho phép bạn hợp tác với một đội ngũ giàu kinh nghiệm, mà không cần phải đầu tư lớn để xây dựng năng lực chuyên môn tương ứng trong nội bộ. Do các công thức sinh phẩm có sự khác nhau về nồng độ và thành phần, nên mỗi sản phẩm sẽ cần một quy trình thu hồi được tối ưu riêng biệt. “Quy trình thu hồi nội độc tố luôn là một dự án nghiên cứu,” Tiến sĩ Faderl nhận định.
“Nếu không có kinh nghiệm, bạn sẽ không biết dự án sẽ đi đến đâu hoặc mất bao lâu. Ngược lại, một công ty có kinh nghiệm sẽ có khả năng dự đoán trước các vấn đề và những yếu tố quan trọng.”
Đơn vị Dịch vụ Nội độc tố ENDOXPERTS™ của bioMérieux cung cấp dịch vụ phát triển và tối ưu hóa quy trình xét nghiệm chuyên biệt cho hiện tượng LER, bao gồm cả việc ứng dụng công nghệ ENDO-RS độc quyền. ENDOXPERTS của bioMérieux đã bắt đầu thực hiện các dự án thu hồi nội độc tố từ năm 2015, với 5–10 dự án mỗi năm.
“Chúng tôi bắt đầu thực hiện các dự án thu hồi nội độc tố ngay sau khi hiện tượng LER được phát hiện, vì vậy chúng tôi hiện là đơn vị có nhiều kinh nghiệm nhất trên thị trường, và đã hợp tác với các công ty dược hàng đầu để phát triển các phương pháp được xác thực, đáp ứng yêu cầu từ cơ quan quản lý,” Tiến sĩ Faderl khẳng định.¹⁶
“Khi hợp tác với chúng tôi, chúng tôi sẽ trao đổi về sản phẩm, công thức đang sử dụng và các nghiên cứu mà bạn đã thực hiện. Sau đó, chúng tôi phân tích công thức sản phẩm tại phòng thí nghiệm của bioMérieux,” Tiến sĩ Faderl cho biết, đồng thời ước tính rằng giai đoạn xác định nguyên nhân gốc rễ này mất khoảng 1–2 tháng. “Khi đã hiểu đầy đủ về sản phẩm của bạn và nguyên nhân gây ra LER, chúng tôi sẽ thống nhất kế hoạch thực hiện dự án thu hồi nội độc tố.”
Quy trình tại bioMérieux được xây dựng trên nền tảng kiến thức chuyên sâu về nội độc tố và LER, và toàn bộ các thí nghiệm cần thiết để phát triển quy trình thu hồi nội độc tố đều do bioMérieux thực hiện, trong khoảng thời gian 6–9 tháng.
Kết thúc giai đoạn phát triển, bioMérieux sẽ bàn giao một quy trình thu hồi nội độc tố ổn định, được tối ưu hóa riêng cho sản phẩm thuốc của bạn. Danh mục giải pháp LER của bioMérieux bao gồm các điều chỉnh như: thay đổi loại chai/lọ chứa, điều chỉnh pH, thay đổi quy trình trộn, bổ sung cation như Mg²⁺, sử dụng chất phân tán như pyrosperse, hoặc các xử lý khác như bổ sung enzyme hay dung môi hữu cơ.
bioMérieux: Dịch vụ thu hồi nội độc tố toàn diện, phù hợp với nhu cầu
Sau khi bên thứ ba đã phát triển xong quy trình thu hồi nội độc tố cho sản phẩm thuốc, điều quan trọng là phải đảm bảo quy trình đó hoạt động hiệu quả trong hệ thống kiểm soát chất lượng nội bộ tại phòng thí nghiệm. Trong khi một số phòng thí nghiệm bên ngoài chỉ thực hiện các thí nghiệm cần thiết rồi chuyển giao kết quả để tự phân tích và áp dụng, thì bioMérieux cung cấp dịch vụ chuyển giao phương pháp hoàn chỉnh và toàn diện.
Khi quy trình thu hồi đã được xác thực, bioMérieux sẽ tiến hành chuyển giao phương pháp và đào tạo trong vòng 1–2 tháng. Sau đó, bioMérieux tiếp tục cung cấp hỗ trợ đầy đủ, nhằm đảm bảo rằng quy trình hoạt động hiệu quả trong phòng thí nghiệm và tích hợp trơn tru vào các quy trình kiểm soát chất lượng hiện tại.
Đội ngũ ENDOXPERTS™ của bioMérieux mang đến chuyên môn sâu, kinh nghiệm thực tế và cam kết rằng quy trình sẽ vận hành tốt trong nội bộ, mà không phát sinh các chi phí lớn để đào tạo nhân sự từ đầu. Hơn thế nữa, kinh nghiệm dày dặn của bioMérieux trong lĩnh vực LER và các giải pháp này đảm bảo rằng dự án được thực hiện một cách nhanh chóng, gọn gàng và tối ưu chi phí.
_____ Các hóa chất được sử dụng trong quá trình sản xuất thuốc sinh học có thể che khuất nội độc tố, dẫn đến hiện tượng thu hồi nội độc tố thấp (LER) trong các phép thử phát hiện nội độc tố. Tuy nhiên, nội độc tố bị che khuất vẫn có thể kích hoạt phản ứng miễn dịch, gây nguy hiểm cho bệnh nhân. Do đó, các công ty sản xuất thuốc sinh học phải chứng minh rằng quy trình thử nội độc tố của họ không chỉ đáng tin cậy, mà còn không gặp vấn đề với nội độc tố bị che khuất và hiện tượng LER.
_____ Phục hồi hoạt tính nội độc tố có thể là một quy trình phức tạp, và việc xây dựng các quy trình nhằm phục hồi một cách đáng tin cậy hoạt tính của nội độc tố đòi hỏi bộ kỹ năng chuyên biệt cao. Mặc dù các quy trình phục hồi này có thể được phát triển và thẩm định nội bộ, việc thuê ngoài dịch vụ phát triển quy trình phục hồi hoạt tính nội độc tố có thể giúp tiết kiệm thời gian và chi phí, đồng thời mang lại một phương pháp an toàn và đáng tin cậy hơn.
_____ Tuy nhiên, điều quan trọng là chỉ nên hợp tác với những đơn vị có phòng thí nghiệm chuyên về LER và đã được chứng minh hiệu quả thực tế. bioMérieux hiện là đơn vị có nhiều kinh nghiệm nhất trong lĩnh vực LER, và đang sở hữu bộ kit thu hồi nội độc tố duy nhất hiện có trên thị trường. Ngoài ra, họ cung cấp một dịch vụ toàn diện cho LER, bao gồm cả thử nghiệm định kỳ và phát triển quy trình thu hồi nội độc tố để chuyển giao cho sản xuất nội bộ.
_____ “Bất kỳ ai đang gặp khó khăn với vấn đề LER đều có thể liên hệ với bioMérieux, và chúng tôi sẽ đồng hành cùng họ để giải quyết vấn đề, đảm bảo quy trình thử nội độc tố đạt độ tin cậy cần thiết,” Tiến sĩ Faderl chia sẻ.
Minh Khang là nhà phân phối độc quyền các sản phẩm kiểm tra vi sinh vật hãng bioMérieux (Pháp).
EN